SEROLOGIA KIŁY
Serologia- badanie płynów ustrojowych.
Kiła (lues, syphilis)- informacje ogólne.
Wywołuje ją krętek blady (Treponema pallidum), należący wg Bergeya do:
IX rzędu- Spirochetales
rodzina- Spirochetaceae
rodzaj- Treponema
Szczepy chorobotwórcze Treponema:
· T.pallidum- kiła
· T.pertenue- malinica
· T.carateum- pinta
· T.bejel- bejel
Szczepy saprofityczne, żyjące na błonach śluzowych:
· T.mucosum
· T.microdentium- 3-4 skręty
· T. macrodentium- 48 skrętów
· T.genitale
· T.calligyrum
Szczepy laboratoryjne:
· szczep Nicholsa T.pallidum- (chorobotwórczy szczep)
· szczepy saprofityczne:
- Reitera
- Nagucciego
- Kazane
Technika barwienia:
T.pallidum nie barwi się metodą Grama (trudnobarwliwa bakteria- można osmem, srebrem, błękitem metylenowym, fuksyną zasadową). Rutynowo barwienia nie wykonuje się.
Oddychanie- beztlenowiec względny.
Rozmnażanie- przez podział poprzeczny. Czas podziału- 33 godziny.
Hodowla:
- na sztucznym podłożu Nelsona żyje ok. 6 h, ale się nie rozmnaża,
- jedyna forma hodowli to hodowle biologiczne czyli PASAŻE - wszczepianie zawiesiny krętków do jąder królików. Po 11-12 dniach usypia się królika. Z jąder pobiera się tkankę. Zanurza się w soli fizjologicznej, częścią szczepi się nowe króliki, a część posłuży do badań ( odczyny swoiste).
Wrażliwość na czynniki zewnętrzne:
- na wysychanie, na wysoką temperaturę
- na związki chemiczne (roztwór mydła- kilka minut)
- można przechowywać mrożone (zachowują immunogenność).
Preparat bezpośredni pod mikroskopem z ciemnym polem widzenia:
- spiralna bakteria o regularnych symetrycznych skrętach, 4-16 skrętów.
Ruch w kropli wiszącej:
- postępowy ( do przodu i do tyłu)
- obrotowy (dookoła osi podłużnej)
- wahadłowy
- flagowy.
Antygeny krętka bladego:
- lipidowy
- białkowe(2)
- wielocukrowo- białkowy.
SEROLOGIA
antygen
przeciwciała
test serologiczny
lipidowy
reaginy
klasyczny
białkowy grupowy
-
FTA
białkowy typowy
FTA-ABS
polisacharydowo-białkowy
immobilizyny
TPI
pozytywizacja odczynów serologicznych:
2-3 tygodnie
TPHA
p-ciała przeciw antygenom T.pallidum
3-4 tygodnie
FTA, FTA-ABS
przeciw antygenom białkowym
4-6 tygodni
klasyczne
7-9 tygodni
kolejność negatywizacji odczynów serologicznych w badaniach kontrolnych po leczeniu kiły:
Klasyczne odczyny kiłowe(nieswoiste):
Wykrywają reaginy (p-ciała antylipidowe IgG i IgM). Polegają na oddziaływaniu p-ciał zawartych w surowicy kiłowej z nieswoistymi antygenami lipidowymi (kardiolipinowymi, lecytyna, cholesterol- nie ma ich u krętków, są tylko podobne budową do antygenów krętkowych.Za to występują w tkankach ludzkich i w otoczkach bakteryjnych).Zastosowanie: USR- przesiewowy, VDRL- diagnostyka, kontrola po leczeniu, weryfikacja.
- odczyn Kolmera, o.Kana, o.cytocholowy- z użyciem wyciągu z serca wołu
- odczyn Wassermana-Brucka-Neissera ( WR)- z wątroby płodów kiłowych
OWD ma już znaczenie historyczne.
Dodatnie od 5-6 tygodnia od zakażenia. Łatwy do wykonania. Stosuje się świeżo przygotowany antygen kardiolipinowy oraz surowicę badaną, którą ogrzewa się w 56º C przez 30 minut w celu unieczynnienia dopełniacza. Wada- czasochłonny (ok.2 h).
Wysokie miana świadczą o czynnej postaci kiły, niskie miana - wiele lat po leczeniu. Po leczeniu kiły wczesnej objawowej miano spada w czasie 3 miesięcy; po leczeniu kiły utajonej wczesnej- po 6-12 miesiącach.
Jeśli przed leczeniem wysokie miano nie ulega obniżeniu, należy podejrzewać rozwój kily układu nerwowego. Wzrost 4-krotny- reinfekcja, niepowodzenie leczenia.
Leczenie w 3 pierwszych miesiącach- negatywizacja VDRL w czasie 6-12 miesięcy.Jeśli później- dodatnie wyniki mogą utrzymywać się przez wiele lat.
- jeden z testów stosowanych w diagnostyce
- kontrola po leczeniu
- test weryfikacyjny
- stosowany do badań przesiewowych, trochę niesłusznie, bo jest długotrwały.
Zastosowanie zmodyfikowanego antygenu kardiolipinowego, który dzięki dodatkowi chlorku choliny, działa unieczynniająco na dopełniacz i inne czynniki surowicze hamujące przebieg odczynu kłaczkującego. Nie trzeba więc podgrzewać surowicy, co znacznie skraca czas wykonania odczynu. Bardziej czuły od VDRL, trochę mniej swoisty.
-test przesiewowy, nie jest ilościowy.
W VDRL i USR odczyt wyniku- po 4 minutowym wytrząsaniu preparatów. Wyniki oceniamy w mikroskopie w powiększeniu 30x35 - jaki jest stopień skłaczkowania.
+/- wynik wątpliwy
- wynik ujemny ( bez skłaczkowania)
+ wynik dodatni
+ +
+ + +
+ + + + wynik wybitnie dodatni
Ocena makroskopowa. Wykorzystuje obecność kolorowej substancji w antygenie.
Odczyny swoiste:
Stosowane antygeny: całe komórki krętków bladych (żywe lub utrwalone) lub fragmenty krętków rozbitych ultradźwiękami.
W 7-9 tygodniu. Polega na zjawisku unieruchamiania, w obecności czynnego dopełniacza ze świnki morskiej płci męskiej (świnki mają bardzo dużo dopełniacza, u nich raczej nie ma zmian poziomu tych białek), żywych patogennych krętków szczepu Nicholsa i utrzymywanych przy życiu na sztucznym podłożu Nelsona (zawiera pewne aminokwasy) przez 17-18 h w 37º C.
Immobilizyny- p-ciała unieruchamiające krętki, IgG, przeciwko antygenowi wielocukrowemu. Występują jedynie w surowicy osób zakażonych krętkami patogennymi i dlatego + wynik odczynu stanowi potwierdzenie rozpoznania kiły lub krętkowic endemicznych. Wynik odczynu jakościowego oznacza się na podstawie odsetka unieruchamiania krętków w mikroskopie z ciemnym polem widzenia:
wynik ujemny- 0-20% unieruchomionych krętków
wynik wątpliwy- 21-50%
słabo dodatni- 51-80%
dodatni- 81-100%
Wady: technika pracochłonna, kosztowna. Wymaga stałego pasażowania patogennych krętków na królikach. Mała przydatność do kontroli wyników leczenia i serologicznego różnicowania kiły i krętkowic niewenerycznych. Zachowanie się tego odczynu- zmienione przy zakażeniu HIV. Brak możliwości automatyzacji tego odczynu ( nie nadaje się do badań kontrolnych).
- diagnostyka kiły późnej ( w Białymstoku).
Od 3-4 tygodnia. W pierwszym etapie odczynu używa się jako antygenu utrwalonych na szkiełku podstawowym krętków szczepu Nicholsa (antygen białkowy grupowy-wspólny dla krętków patogennych i saprofitycznych). Antygeny łączą się z p-ciałami zawartymi w surowicy chorych na kiłę lub krętkowice.
W drugim etapie po dodaniu znakowanej izotiocjanianem fluoresceiny surowicy antygammaglobulinowej ( poliwalentna: IgG, IgM, IgA), następuje połączenie powstałego kompleksu ze znakowanymi p- ciałami skierowanymi przeciw immunoglobulinom ludzkim, co pozwala na odczytywanie wyników w mikroskopie fluorescencyjnym.
!! Za miano odczynu uważa się najwyższe rozcieńczenie badanej surowicy warunkujące fluorescencję odpowiadającą oznaczeniu: + (1:450).
Wada- mała swoistość (nie do celów diagnostycznych).
- ocena dynamiki procesu kiłowego (ocena ilościowa)
- kontrola wyników leczenia.
3-4 tydzień. Polega na wstępnej absorbcji badanej surowicy antygenami uzyskiwanymi z krętków hodowlanych- ultrasonat T.phagedenis, biotyp Reiter. Pozwala to na usunięcie p- ciał skierowanych przeciwko krętkom saprofitycznym (swoistość!). Czułość wyższa od TPI, tylko nieco mniejsza swoistość. Ale wyniki fałszywie dodatnie-w chorobach autoimmunologicznych, choroba z Lyme.
- diagnostyka wczesnych okresów zakażenia
- weryfikacja serologiczna rozpoznawania.
Modyfikacja FTA-ABS. Zamiast znakowanej wieloważnej surowicy odpornościowej używa się monowalentnej surowicy przeciw IgM. Reakcje IgM są wysoce charakterystyczne na zakażenie T.pallidum. Wyniki fałszywie dodatnie- obecność czynnika reumatoidalnego, fałszywie ujemne- konkurencyjne blokowanie antygenu przez IgG .
- diagnostyka i ocena aktywności kiły wrodzonej
- ocena reinfekcji
Używa się frakcji 19S(S- jednostka Svedberga)Ig (zawiera wyłącznie IgM) badanej surowicy. Cel- uniknięcie wyników fałszywie dodatnich w FTA-ABS IgM. Oba odczyny wykonujemy dwukrotnie.
2-3 tydzień. Polega na aglutynacji krwinek opłaszczonych ultrasonatem (czyli antygeny zewnętrzne oraz wewnętrzne krętka) krętków szczepu Nicholsa pod wpływem p-ciał surowicy kiłowej uprzednio rozcieńczonej w płynie absorbcyjnym. P-ciała IgM i IgG skierowane są przeciwko antygenom białkowym. Wyniki odczynu jakościowego określa się w zależności od stopnia aglutynacji od + do + + + (+).Rzadziej używana jest metoda ilościowa, którą stosuje się głównie w diagnostyce kiły układu nerwowego.
Czułość odczynu z wyjątkiem wczesnego okresu zakażenia przewyższa czułość wszystkich innych odczynów kiłowych, a swoistością nie różni się od FTA-ABS.
- test weryfikacyjny( gdy są wątpliwości diagnostyczne)
Modyfikacja TPHA. Do ścianek studzienki płytki są przytwierdzone przeciwciała anty-IgM (faza stała). Surowica badana- faza płynna. Dodajemy więc surowicy z p-ciałami IgM. Potem dodajemy krwinek opłaszczonych ultrasonatem szczepu Nicholsa. Jeśli jest to wiązanie swoiste dla zakażenia kiłowego, krwinki przytwierdzą się do ścianek studzienki (tzw. tapetowanie studzienki).Wada- kosztowny.
-test weryfikacyjny
Inne testy:
testy weryfikacyjne:
jednocześnie TPHA, FTA-ABS, VDRL (TPI). Każdy wykrywa inne przeciwciała. Muszą być zrobione równolegle- z jednego pobrania krwi.
diagnostka kiły wczesnej:
VDRL+FTA-ABS (lub FTA)
odczyny biologiczne mylne:
a) fałszywie ujemne- przyczyny przedlaboratoryjne i laboratoryjne.
Reakcja prozonalna- przyczyną jest wysokie stężenie p-ciał antykardiolipinowych (trzeba rozcieńczyć surowicę).
b) fałszywie dodatnie
Dotyczy to odczynów klasycznych (20-40% z nich), FTA (3-7%), FTA-ABS ( 1-1,5%).
-ostre: przemijające, utrzymujące się od kilku tygodni d...
MMikulicz