Wstęp do bioinformatyki.doc

Wstęp do bioinformatyki

http://srs.ebi.ac.uk

Ważne zakładki, z których będziemy korzystać:

•         Library page

–        EMBL à sekwencje nukleotydowe (DNA, RNA)

–        Uniprot à sekwencje aminokwasowi (białka)

•         Tools – bogaty wybór narzędzi

•         Query form – tutaj budujemy zapytanie do wyszukiwania

•         Results – zbiór wyników przeprowadzonych czynności w danej sesji przeglądarki, pozostałe wyniki wyszukiwania itd. dostępne są również spod linku „Job status”

Cenralny dogmat biologii  molekularnej:

Centralny dogmat biologii molekularnej został sformułowany przez Francisa Cricka (Crick i Watson odkryli budowę DNA)  w 1958 roku. Zakłada on przepływ informacji z genomu komórki, czyli DNA do białek pełniących różnorakie funkcje w komórkach. Sekwencja DNA przepisywana jest na RNA w procesie transkrypcji. Podczas formowania  dojrzalego mRNA dochodzi do slipingu, czyli wycięcia sekwencji niekodujących (intronów) a pozostaja tylko sekwencje kodujące (eksony). Czyli sekwencja mRNA powstała na martycy DNA będzie się od niej różniła. Na martycy powstałego mRNA syntetyzowane jest białko w procesie translacji. W tym procesie każej trójce nukleotydów przypisywany jest jeden aminokwas lub kodon stop (w tym momencie następuje koniec translacji i tym samym koniec bialka). Jednakże wiele aminokwasów jest kodowane przez różne trójki nukleotydów. Czyli na podstawie sekwencji aminokwasowej białka nie możemy jednoznacznie określić jaka była sekwencja mRNA z jakiej ono powstało, ani tymbardziej jaka była sekwencja martycy DNA.

              Z drugiej strony istnieje pojęcie cDNA. cDNA jest sekwencją otrzymaną poprzez odwrotną transkrypcję z RNA. W dzisiejszym ćwiczeniu otrzymamy sekwencję cDNA (bez intronów, odpowiadająca sekwencji RNA z jakiej powstanie białko).

Celem ćwiczeń jest zapoznanie z wybranymi możliwościami narzędzi bioinformatycznych

•         Translacja sekwencji cDNA na sekwencję białkową (Transeq)

•         Identyfikacja białka i wyszukanie najbardziej podobnych białek do badanego (BlastP)

•         Porównanie z wybranymi białkami (ClustaW, NeedleP)

•         Określenie drugorzędowej struktury białka (Garnier)

•         Zbadanie czy białko posiada helisy transbłonowe (Tmap)

•         Przewidywanie lokalizacji białka (ProtComp)

•         Struktura 3D białka (baza PDB, program Jmol)

•         *Dokowanie ligandów do białka – dockingsever.com

Podana jest niezidentyfikowana sekwencja cDNA w formacie FASTA.

              Format FASTA jest formatem zapisu sekwencji kwasów nukleinowych oraz aminokwasowych stosowanym w bioinformatyce. Nukleotydy (dla DNA i RNA) oraz aminokwasy (dla białek) oznaczone są jednoliterowymi skrótami. Format FASTA pozwala także dodawać opisy i komentarze do sekwencji. Sekwencja w tym formacie poprzedzona jest symbolem „>„. Pierwsze słowo po tym znaku służy jako identyfikator sekwencji.               Dalej w tej samej linii umieszczany jest opis. W kolejnych liniach znajduje się ciąg znaków składający się na sekwencję. Zwykle formatowane do 60 znaków w linii. Puste linie w pliku FASTA są ignorowane lub traktowane jako zakończenie sekwencji, podobnie w przypadku kresek, podkreślenia, przecinków. W jednym pliku FASTA może być kilka sekwencji umieszczonych pod sobą.

1.  Mamy naszą sekwencję cDNA. Należy wyszukać odpowiednie narzędzie aby zrobić translację na białko: Tools à nucleid Tools à Nucleic Translation à Transeq – Translate nucleic acid sequences à wybieramy „Launch” i wklejamy sekwencje i naciskamy „launch". W prawym górnym rogu pokazuje się Job statys – jak klepsydra będzie zielona – wystraczy na nią kliknąć, żeby zobaczyć rezultat pracy,

2.  Alignment (brak odpowiedniego słowa w języku polskim; stosuje się uliniowienie albo dopasowanie sekwencji)  jest sposobem dopasowania sekwencji nukleotydowych lub białek do zidentyfikowania regionów wykazujących podobieństwo, mogących wynikać z pdobnej funkcji, struktury lub powiązań ewolucyjnych pomiędzy tymi sekwencjami. Możemy je podzielić na metody globalne i lokalne.
Dopasowania globalne, obejmujące pełny zakres wszystkich sekwencji, są najbardziej użyteczne, gdy zestawiane sekwencje są podobne i o zbliżonych rozmiarach. Sekwencje są rozciągane na tę samą długośc i poszczególnie miejsca są analizowane. Ogólna technika dopasowania globalnego jest znana jako algorytm Needlemana-Wunscha i jest oparta na programowaniu dynamicznym. Przykład programu – ClustalW.
Dopasowania lokalne są bardziej przydatne dla sekwencji nie wykazujących w całości większego podobieństwa, co do których istnieje przypuszczenie, że zawierają podobne podsekwencje czy motywy. W przypadku dopasowania lokalnego (algorytm Smitha-Watermana)  badane jest podobieństwo w obrębie krótszych regionów w sekwencjach. Przykład programu – BLAST.
W przypadku sekwencji aminokwasowych jeden aminokwas może być kodowany przez różne trójki nukleotydów, różne będą więc kary za zmiany punktowe w sekwencji ze względu na fenotypowe efekty (czy zmiana w sekwencji nukleotydowej niesie zmianę w białku, jeśli tak, to czy powstalyw  tym miejscu aminokwas ma podobne właściwości czy inne itd., odpowiednie przeliczniki zawarte są w tzw. Macierzach porównań.
Kolejną kwestią są kary za przerwy w sekwencjach – możemy ustalić jaka ma być kara za rozpoczęcie przerwy i za każda kolejną pozycje przerwy. To jest właśnie Gap-penalty czyli kary za przerwy (indele).
Ostatecznie dla każdej pary porównanych sekwencji policzony zostaje score. Im wyższy – tym sekwencje wykazują większe podobieństwo, ale nie należy tego interpretować zbyt pochopnie, bo wiele zależy także od długości porównywanych sekwencji. W zależności od długości sekwencji ten sam wynik może być uznany za nieistotny lub wręcz przeciwnie.

3.  Ze względu na przyrównywane sekwencje możemy podzielić BLAST wg poniższej tabeli:

4.  Mamy naszą uzyskaną po translacji sekwencję białkową, przeszukamy Blastem bazę sekwencji białkowych, aby znaleźć podobne białka… może nasza sekwencja jest sekwencją jakiegoś istniejącego białka :)
Kopiujemy uzyskaną sekwencję aminokwasowi, wchodzimy w Tools à Similarity Search Tools à NCBI BLASTP Protein vs. Protein Sequence Similarity Serach à Launch
Wklejamy sekwencję i naciskamy ‘launch’, czekamy na wyniki w Job status
… czyli wiemy, że to receptor dla glukokortykoidów

Sprawdźmy teraz, czy będzie on miał podobną sekwencję u różnych gatunków zwierząt.
Będziemy przeszukiwać bazę sekwencji białkowych à wchodzimy w Library page i wybieramy UniprotKB (all) à przechodzimy do Query Form i wyszukujemy sekwencji dla receptora dla glukokortykoidów - z listy rozwijanej wybieramy description = Glucocorticoid receptori wybieramy serach. Wśród wyszukanych wyników zaznaczamy te dotyczące świni, człowieka, myszy i szczura. Przewijamy do góry strony i zaznaczamy selected results only oraz z Launch analysis tool: wybieramy z rozwijanej listy ClustalW à Launch. Automatycznie zostaly umieszczone tu wybrane sekwencje do porównania. Naciskamy „launch” à Job status

à porównujemy zestawione sekwencje
 

Żeby zobaczyć, które sekwencje są najbardziej podobne, a które najbardziej się różnią możemy użyć narzędzia NeedleP. Wracamy do wyników wyszukanych sekwencji receptora dla glukokortykoidów, porównujemy parami sekwencje: Człowiek – świnia, Człowiek – mysz, Człowiek – szczur; Dla każdej z pary uruchamiamy narzędzie NeedleP 

5.  Powracamy do sekwencji aminokwaswej ludzkiego receptora dla glukokortykoidów: Cofnąć się do wyników wyszukiwania i zobaczyć do jest w informacjach o tym receptorze: linki do publikacji w Medline, DrugBank, itd.. a na dole sekwencja à Kopiujemy sekwencję i sprawdzamy jakia strukturę drugorzędową posiada białko. Tools à Protein Tools à Protein 2D structure à Garnier  à wklejamy sekwencje à Launch à Job status

HHH = helisa

EEE = beta-kartka
TTT = skręt

CCC = nitka

6.  Teraz sprawdzmy sekwencję aminokwasowi receptora dla glukokortykoidów na obecność białek transmembranowych: à Kopiujemy sekwencję à. Tools à Protein Tools à Protein 2D structure à Tmap  à wklejamy sekwencje à Launch à Job status à Tmap à Graphic view: kreska nad wykresem określa potencjalne miejsce dla helisy transblonowej, ale skoro tylko jednak to raczej nie jest to białko transbłonowe ( te „lubią mieć” 7 helis transbłonowych)

7.  Przejdźmy na inną stronę : softberry.com

Tutaj sprawdzimy gdzie prawdopodobnie lokuje się badane białko:

Protein Location à ProtComp (Animal/Fungi)

Białka po translacji mają sekwencje sygnałowe, dzieki którym są kierowane do odpowiednich przedziałów komorkowych. Tutaj na podstawie tych sekwencji możemy przewidywać jaka jest lokalizacja białka. Wklejamy sekwencję à process à obliczone wyniki dla poszczególnych lokalizacji. Receptor dla glukokortykoidów mieści się w cytoplazmie a po związaniu ligandu kierowany jest do jadra komórkowego, gdzie działa jako czynnik transkrypcyjny. Ostatnie publikacje sugerują także jego lokalizację w błonie komórkowej i innych kompartymentach komórkowych, co również przewidziała metoda sieci neuronowych.

8.  Zobaczmy jeszcze jak wygląda trzeciorzędowa struktura tego białka: wchodzimy na stronę http://www.rcsb.org

Wyszukujemy receptora dla glukokortykoidów z deksametazonem (Glucocorticoid receptor dexamethasone). Spośród wyników wybieramy 1M2Z. Wybieramy view in Jmol à możemy obracać, zmieniać widocznośc elementów itd…

9.  * Zadanie dodatkowe: Dokowanie ligandu do białka.

Jako białko mamy gotowy plik - strukturę domeny wiążącej ligand receptora dla glukokortykoidów (plik domena A), wyszukać w bazie http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov dowolny potencjalny ligand (np. prednizon, deksametazon, betametazon). Obie struktury (białko i ligand) muszą być w formacie PDB.

Na stronie http://www.dockingserver.com wybieramy Pricingà Guest account/starting now à Docking -> My proteind – wgrywany Domenę A, My ligands – wgywamy ligand à wyniki po chwili w My dockings