4.5 CHROMATOGRAFIA
Chromatografia, „pisanie kolorem” (gr. chroma = kolor + graphe = pisanie) jest techniką
służącą do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych. W metodzie
tej następuje rozdział mieszaniny składników pomiędzy dwie fazy: fazę nieruchomą - stacjonarną,
(bibuła filtracyjna, cienka warstwa adsorbentu naniesiona na płytkę, wypełnienie kolumny),
oraz fazę ruchomą - mobilną. Faza ruchoma stanowi tu siłę napędową procesu, z kolei
faza nieruchoma odgrywa rolę siły hamującej migrację składników. Rozdział substancji
pomiędzy obie fazy następuje na skutek różnicy współczynników podziału składników mieszaniny
pomiędzy obydwie fazy. Szybkość migracji substancji jest tym większa im mniejszy
jest współczynnik podziału (mniejsze powinowactwo składnika do danej fazy).
W ogólnym przypadku, chromatograficzny rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia
roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę stacjonarną. Podczas
przepływu eluentu (fazy ruchomej) przez fazę stacjonarną następuje proces wymywania zaadsorbowanych
(lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych
składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie stacjonarnej
dłużej, a inne krócej (inna jest retencja), dzięki czemu może następować ich separacja.
Chromatografia stosowana jest zarówno do badań jakościowych, ilościowych, jak i dla celów
preparatywnych. Sprzężenie, chromatografii gazowej z innymi metodami, na przykład spektrometrią
masową lub spektrofotometrią w podczerwieni, znacznie rozszerza możliwości
identyfikacji rozdzielanych składników.
4.5.1 PODZIAŁ METOD CHROMATOGRAFICZNYCH
Metody chromatograficzne można klasyfikować według wielu kryteriów. W zależności od
rodzaju zastosowanego eluentu, czyli medium wymywającego, rozróżnia się następujące
techniki chromatograficzne:
• chromatografia cieczowa, w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik lub mieszanina
rozpuszczalników,
• chromatografia gazowa, w której eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel),
• chromatografia fluidalna , w której eluentem jest ciecz w stanie nadkrytycznym (fluid).
43
Z kolei, w zależności od stanu skupienia fazy nieruchomej= stacjonarnej, wyróżnia się chromatografię
w układzie:
Faza ruchoma Faza stacjonarna Chromatografia
• Gaz - ciecz GLC (ang. Gas-Liquid Chromatography) gdzie fazą ruchomą
jest gaz, a fazą stacjonarną ciecz naniesiona na nośnik.
Przypadek chromatografii adsorpcyjnej
• Ciecz - ciecz LLC (ang. Liquid- Liquid Chromatography). Rzadko stosowana
technika z uwagi na wzajemną rozpuszczalność
cieczy. W praktyce stosuje się odmianę tej techniki, w której
faza ciekła jest chemicznie związana ze stałym nośnikiem.
• Gaz - ciało stałe GSC (ang. Gas- Solid Chromatography) Technika GSC
stosowana jest do identyfikacji i oznaczania składników
mieszanin gazów oraz związków organicznych, które można
bez rozkładu przeprowadzić w stan pary. W przypadku
analizy związków nielotnych próbkę rozpuszcza się w odpowiednim
rozpuszczalniku i wstrzykuje do odparowalnika.
Tutaj zostaje przeprowadzona w stan gazowy i dalej
przepływa z gazem nośnym przez termostatowaną kolumnę,
na której ma miejsce rozdział składników. Próbkę
wstrzykuje się przed kolumną do strumienia gazu nośnego
przepływającego z określoną prędkością i pod zdefiniowanym
ciśnieniem.
W chromatografii gazowej zasadniczy wpływ na rozdzielanie
mieszanin mają różnice lotności separowanych składników.
Do identyfikacji jakościowej i ilościowej związków
wykorzystuje się tutaj właściwe dla nich czasy wyjścia
składnika z kolumny i objętości retencji (powierzchnie piku).
Objętość retencji jest to objętość gazu nośnego, jaka
przejdzie przez kolumnę do momentu osiągnięcia maksymalnej
wartości piku (szczytu piku) oznaczanej substancji.
Na końcu kolumny znajduje się sprzężony z rejestratorem
44
detektor, czuły na zmiany składu gazu. Sygnały z detektora
zapisywane są przez rejestrator. Tak powstaje wykres zależności
stężenia poszczególnych składników od czasów
ich retencji.
• Ciecz - ciało stałe LSC (ang. Liquid- solid Chromatography). W technice
LSC rozdział substancji następuje na skutek dynamicznej
konkurencji pomiędzy rozdzielanymi cząsteczkami i rozpuszczalnikiem
(fazę ruchomą, eluent) o miejsca aktywne
na powierzchni fazy stacjonarnej (adsorbentu). Składniki
rozdzielanej mieszaniny i eluent w różnym stopniu oddziaływają
z adsorbentem, mówi się, że mają różne powinowactwo
do adsorbentu i dlatego przemieszczają się przez
adsorbent z różną szybkością. Adsorbenty mogą być polarne
(np. żel krzemionkowy, tlenek glinu) i użyte z mało polarnym
eluentem (np. heksan, chloroform, heksan z octanem
etylu) lub w tzw. wersji z odwróconymi fazami, adsorbenty
odpowiednio niepolarne (np. polimery) i eluenty
polarne (np. woda, metanol).
W zależności od natury zjawisk stanowiących podstawę procesu chromatograficznego wyróżnia
się:
• chromatografię adsorpcyjną opartą na różnym powinowactwie adsorpcyjnym składników
mieszaniny do odpowiednio dobranej powierzchni fazy stacjonarnej,
• chromatografię podziałową, uwarunkowaną różnicami w wartościach współczynnika
podziału składników mieszaniny między dwie nie mieszające się fazy, z których jedna
jest fazą stacjonarną (ciecz) osadzoną na nośniku, a druga fazą ruchomą (ciecz, fluid,
gaz). W ramach chromatografii podziałowej wyróżnia się:
a. chromatografię podziałową klasyczną, w której fazą stacjonarną jest polarna
ciecz, np. woda osadzona na obojętnym nośniku (żel krzemionkowy lub
bibuła- kompleks celuloza-woda).
Rozpuszczona w fazie ruchomej próbka ulega podziałowi między obydwie
fazy. O rozdziale decyduje prawo podziału Nernsta:
K=
c1
c2
45
gdzie c1 i c2 oznaczają stężenia poszczególnych związków próbki w fazach
ruchomej i stacjonarnej. Wartość ta charakteryzuje efektywność rozdziału
składników mieszaniny w czasie przepływu przez fazę stacjonarną.
b. chromatografię podziałową z odwróconymi fazami. W technice tej faza
stacjonarna jest niepolarna (np. węglowodór), a ruchoma polarna (np. woda).
c. chromatografię podziałową par jonowych, która używana jest do rozdzielania
związków jonowych i ulegających jonizacji. W tym przypadku pary
jonowe tworzą się w wyniku asocjacji cząsteczek z odpowiednio dużymi
jonami organicznymi i w wyniku selektywnego podziału przechodzą do
umiarkowanie solwatującej fazy wodno-organicznej.
• chromatografię jonowymienną, której podstawą jest reakcja wymiany jonowej pomiędzy
jonami z roztworu a jonami związanymi z fazą stacjonarną, występującą w postaci
jonitów (nierozpuszczalnych kwasów R-SO3H, gdzie R- polimer). Chromatografia
jonowymienna służy do rozdzielania związków jonowych lub łatwo ulegających
jonizacji. Adsorbentem w tej technice jest żywica (np. kopolimer styrenu i dwuwinylobenzenu)
zawierająca dodatkowe grupy funkcyjne. Jeśli są to grupy zawierające
reszty kwasowe (np. sulfonowe) to będą one reagować z kationami. Takie żywice nazywamy
kationitami. Np.:
Z kolei żywice wymieniające aniony noszą nazwę anionitów i są nierozpuszczalnymi
zasadami. Zawierają one reszty anionowe. Równowagę opisującą adsorpcję anionu
chlorkowego na takim wypełnieniu można zapisać następująco:
W kombinację tego typu kationitu i anionitu wyposażone są odsalacze wody morskiej
na tratwach ratunkowych.
Zróżnicowanie retencji z kolumny jonitowej (wypełnionej kationitem lub anionitem)
zaadsorbowanych jonów (odpowiednio anionów lub kationów) uzyskuje się manipulując
rodzajem żywicy (jonit silnie lub słabo kwasowy/zasadowy), zmieniając pH eluentu
(np. dobierając odpowiedni szereg buforów) lub jego siłę jonową.
chromatografię sitową – żelową - sączenie molekularne. Metoda ta, będąca odmianą
kolumnowej chromatografii cieczowej, polega na wprowadzeniu badanego roztworu
na kolumnę wypełnioną usieciowanym, obojętnym chemicznie złożem i eluowaniu
kolumny tym samym rozpuszczalnikiem. Rozwój techniki sączenia molekularnego
rozpoczął się w końcu lat 50-tych, kiedy to wprowadzono do zastosowań żel dekstranowy
pod nazwą handlową Sephadex®. Rozdział związków w chromatografii żelowej
dotyczy prawie wyłącznie związków wielkocząsteczkowych i polega na frakcjonowaniu
cząsteczek pod kątem różnej ich masy i kształtu. Zjawisko tłumaczy się między
innymi za pomocą teorii mechanicznej, która zakłada, że w porowatym, usieciowanym
materiale złoża, małe cząsteczki swobodnie przenikają do porów, a większe trudniej.
Stąd większe cząsteczki migrują przez kolumnę szybciej, a mniejsze wolniej. Wymywanie
następuje w kolejności malejących rozmiarów cząsteczek. W odróżnieniu od
innych technik chromatografii cieczowej, próbka wymywana jest przed rozpuszczalnikem.
Skutkiem tego, czasy retencji są stosunkowo krótkie. Wadą chromatografii żelowej
jest brak możliwości zastosowania jej do rozdzielania związków o podobnej
masie cząsteczkowej. Dlatego też, sączenie molekularne nie jest wykorzystywane do
rozdzielania skomplikowanych mieszanin, ale raczej wstępnego rozseparowania frakcji
różniących się wyraźnie masami cząsteczkowymi. I tak, w przypadku mieszaniny
tej samej klasy związków (np. peptydów) ulegają wymywaniu kolejno frakcje związków
o malejącym ciężarze molowym. Dysponując wzorcową mieszaniną można powiązać
czasy retencji jej składników z ich ciężarem molowym (wyrażonym w Daltonach).
Otrzymana zależność może posłużyć do wyznaczania ciężaru molowego składników
nieznanej mieszaniny. Jest to metoda szczególnie przydatna dla rozdzielania
enzymów i białek.
Kolejny podział metod chromatograficznych wynika z możliwości zastosowania różnorodnych
technik rozdziału badanego materiału.
• Chromatografia (technika) kolumnowa,
• Chromatografia (technika) planarna, możliwa tylko w chromatografii cieczowej. W
jej ramach można wyróżnić:
a. technikę cienkowarstwową TLC (ang. Thin Layer Chromatography),
b. technikę bibułową.
Z kolei, ze względu na parametry procesu można mówić o :
• wysokosprawnej/ciśnieniowej chromatografii cieczowej, HPLC (ang. High Performance/
Pressure Liquid Chromatography,), która jest odmianą cieczowej chroma47
tografii kolumnowej, z użyciem eluentu pod wysokim ciśnieniem. Technika HPLC
stosowana jest w przypadku trudnych podziałów, np. w sytuacji gdy rozdzielić trzeba
związki niewiele się różniące lub gdy stawia się wysokie wymagania co do czystości
izolowanych związków. Zastosowanie, w takim przypadku, zwykłej chromatografii
kolumnowej musi prowadzić do wydłużenia drogi, którą pokonuje rozdzielana próbka
przez wypełnienie (wydłużenie kolumny) oraz/lub zastosowanie aktywniejszych wypełnień.
W takim jednak przypadku złoże stwarza opór, co zwalnia lub uniemożliwia
przeprowadzenie rozdziału. Opór ten pokonuje się nanosząc eluent pod wysokim ciśnieniem
w celu wymuszenia optymalnego przepływu. Rozwój systemów wprowadzania
i pompowania roztworów, doskonalenie wypełnień kolumn oraz dostępność
standaryzowanych rozpuszczalników wpłynęła na intensywny rozwój wysokosprawnej
chromatografii cieczowej HPLC. Większe ciśnienia stosowane w HPLC w porównaniu
z tradycyjną chromatografią kolumnową wymagają zastąpienia kolumn szklanych
metalowymi. HPLC jest szczególnie przydatna dla związków, których ze względu
na ich małą stabilność nie da się analizować tańszą metodą chromatografii gazowej.
Metoda ta znalazła zastosowanie m.in. do rozdzielania związków fizjologicznie
czynnych.
• Szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa, FPLC – (ang. Fast
Protein/Performance Liquid Chromatography) będąca odmianą HPLC działającą na
niższych ciśnieniach, stosującą prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit
molekularnych. Służy ona głównie do rozdziału białek i polipeptydów.
4.5.2 WYBRANE METODY CHROMATOGRAFICZNE
4.5.2.1 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
Początki chromatografii wiąże się z osobą profesora Michaiła Cwieta, rosyjskiego botanika,
profesora Uniwersytetu Warszawskiego, który 23 kwietnia 1905 r. dokonał pierwszego
chromatograficznego rozdziału mieszaniny barwników organicznych. W pionierskim doświadczeniu
użył on wypełnionej sproszkowanym węglanem wapnia (kredą) kolumny szklanej.
Chloroformowy roztwór barwników organicznych, naniósł na wierzchołek kolumny.
Roztwór, w miarę przechodzenia przez warstwę kredy, ulegał rozdziałowi i poszczególne
składniki były widoczne w postaci barwnych stref. Po wyjęciu słupka kredy z kolumny barwniki
zostały podzielone i wyodrębnione.
48
W kolejnych latach zamiast kredy, do wypełnień kolumn chromatograficznych, stosowano
inne, bardziej efektywne wypełnienia (adsorbenty), dające lepsze rozdziały.
Mimo niewątpliwych zalet chromatografia kolumnowa była jednak stosunkowo kłopotliwa z
powodu braku dobrych adsorbentów i dlatego była rzadko stosowano w laboratoriach chemicznych.
Wrócono do niej po latach, stosując jako wypełnienia kolumn żele krzemionkowe
lub tlenek glinu w postaci granulek o wymiarach ułamka milimetra - np. 0.1 mm.
4.5.2.2 CHROMATOGRAFIA BIBUŁOWA
Poszukując sposobów upraszczania i przyspieszania rozdziałów chromatograficznych,
kolumnę zastąpiono bibułą. W technice bibułowej na pasek lub arkusz bibuły nanosi się mikrostrzykawką
lub kapilarą plamkę (o średnicy do 2 mm) roztworu rozdzielanej mieszaniny.
Koniec paska z naniesioną plamką zanurza się w zamkniętym naczyniu w takiej ilości fazy
ruchomej, aby plamka była nad jej powierzchnią. Faza ruchoma, podobnie jak w chromatografii
kolumnowej, może składać się z jednego rozpuszczalnika lub być ich mieszaniną. Ciecz
wznosząc się w bibule do góry (jest to przykład występowania efektu kapilarnego - bibułę
można rozpatrywać jako zbiór kapilar), zabiera ze sobą składniki mieszaniny, z których jedne
wędrują szybciej, inne wolniej. Różnice w szybkości migracji poszczególnych składników
mieszaniny wynikają z ich odmiennego oddziaływania z fazą stacjonarną (bibuła – kompleks
woda). W wyniku występowania efektu kapilarnego i różnic w oddziaływaniu z fazą stacjonarną
(prawo podziału Nernsta), następuje rozdział mieszaniny . Otrzymuje się chromatogram
w postaci plamek. Jest to chromatografia bibułowa wstępująca. Niekiedy stosuje się chromatografię
zstępującą, w której faza ruchoma migruje w bibule do dołu.
Przy analizie mieszanin zawierających składniki barwne, plamki odpowiadające poszczególnym
związkom chemicznym wchodzącym w skład mieszaniny można zlokalizować wzrokiem.
Gdy plamki nie są barwne (w skład mieszaniny wchodziły związki bezbarwne), dąży
się do ich wizualizacji. Do uwidocznienia chromatogramów stosuje się roztwór ninhydryny,
pary jodu, bromu, roztwór waniliny w kwasie solnym i wiele innych odczynników w zależności
od rodzaju rozdzielanych substancji. Istotą procesu "wywoływania" chromatogramu są
reakcje barwne zachodzące pomiędzy wyodrębnionymi składnikami (lub tylko jednym z wyodrębnionych
składników) i odczynnikiem użytym do wizualizacji plamek. W przypadku
rozdziału mieszanin substancji "znakowanych" izotopami radioaktywnymi, do bibuły przykłada
się kliszę fotograficzną, na której po wywołaniu otrzymuje się zaczernienie jako obraz
49
rozdzielonych składników mieszaniny. Wielkość i zaczernienie plamki, pozwala również na
ilościową ocenę zawartości składnika w mieszaninie.
Jakość rozdziału bardzo zależy od rodzaju użytej bibuły. "Zwykła" bibuła nie jest najlepszym
podłożem do chromatografii, w tym celu produkowane są specjalne ich rodzaje (Whatman,
Schleicher & Schüll).
W latach 50-tych i 60-tych chromatografia bibułowa posłużyła jako narzędzie do
rozwikłania procesów fotosyntezy. Z jej pomocą Melvin Calvin, stosując radioaktywny węgiel
C14 w CO2, zidentyfikował etapy tzw. ciemnej fazy fotosyntezy, zwanej obecnie cyklem
4.5.2.3 CHROMATOGRAFIA CIENKOWARSTWOWA
Udoskonaleniem chromatografii bibułowej jest chromatografia cienkowarstwowa,
TLC (ang. Thin Layer Chromatography). Zamiast bibuły, stosuje się tutaj płytkę szklaną lub
folię aluminiową pokrytą warstwą żelu krzemionkowego, tlenku glinu lub celulozy. Do celów
analitycznych stosuje się płytki z warstwą żelu nie przekraczającą grubości rzędu 0.15 mm.
Wśród zalet chromatografii cienkowarstwowej wymienić należy:
• lepszy rozdział mieszanin niektórych grup związków niż chromatografia bibułowa,
• większą szybkość rozwijania chromatogramu niż w chromatografii bibułowej,
• ograniczenie zjawiska dyfuzji (plamki są mniej rozmyte niż na bibule),
• większa czułość metody (możliwość detekcji mniejszej ilości substancji),
• stosunkowo prosta i dokładna metoda identyfikacji i ilościowego oznaczania związków
rzędu mikrogramów, i wreszcie
• niska cena stosowanego sprzętu.
Nanoszenie plamek, rozwijanie chromatogramu, wywoływanie i ilościowe oznaczanie zawartości
poszczególnych składników wykonuje się podobnie jak w przypadku chromatografii
bibułowej.
50
Sposób wykonania chromatogramu TLC
W celu przeprowadzenia analizy metodą chromatografii cienkowarstwowej wykonać należy
następujące czynności:
• Przygotowanie komory chromatograficznej. Do komory chromatograficznej (zlewka)
wlewa się przygotowany wcześniej roztwór eluentu na wysokość około 0.5 cm. W
celu wysycenia komory parami mieszaniny rozwijającej zlewkę pozostawiamy pod
przykryciem na około 15 minut. W przypadku rozpuszczalników trudno lotnych proces
ten można przyspieszyć umieszczając we wnętrzu zlewki bibułę filtracyjną zwiniętą
w cylinder, zanurzoną w eluencie i przylegającą do ścianek naczynia.
• Przygotowanie płytki chromatograficznej. Wycinamy płytkę chromatograficzną,
której szerokość dostosowana jest do ilości nanoszonych substancji. W tym celu zakładamy
około jednocentymetrowe odstępy pomiędzy nanoszonymi plamkami oraz 1
cm na margines. Wysokość płytki ustalamy tak, aby odstęp pomiędzy linią startu a
górna krawędzią płytki wynosił około 11 cm. Z jednego końca płytki - linia startowa,
w pewnym odstępie od krawędzi (ok. 1 cm), za pomocą ołówka zaznaczamy cienką
linię (tak aby nie uszkodzić warstwy adso...
nauka877