CWICZENIA: DNA- kwas deoksyrybonukleinowy, nośnik informacji genetycznej(inf. o strukyurze bialek, RNA, mechanizmach regulacyjnych zapisanych w postaci sekwencji nukleotydów wystepuje w każdej żywej komórce.1)Rodzaj materialu bioloicznego z jakiego uwalniamy DNA (izolujemy): a)tkanka b)krew-najlepszy materil biologiczny c)muszka owocowa-miksujemy cale organizmy,bakterie,wirusy d)zajace(wlosy,sierśc,ślina, mocz) e)kal-zawiera nablonki f)tkanki zatopione w parafinie g)znalezione stare żeby 2)Metody izolacji DNA: a)metoda klasyczna- polega na ekstakcji bialek mieszanina fenol-chloroform i wytracaniu DNA za pomoca alkoholu izopropylowego lub etanolu b)metoda solna-polega na tym,że bialka nie sa ekstraktowane fenolem-chloroformem, a za pomoca steżonych soli sodu lub litu, odwirowujemy,osad odrzucamy wytracamy DNA alkoholem izopropylowym lub etanolem-procedury uproszczone za pomoca gotowych zestawów(kity),bioroboty ETAPY IZOLACJI DNA 1)pozyskiwanie próby do analizy; najlepiej krew krew pobiera się do probówki, w którym jest już antykoagulant tkanke do analizy należy rozdrobnic 2) pozbywanie się z krwi elementów niekomórkowych żeby uzyskac osad komórek, przemywanie próby buforem PBS(NAH2PO4,NA2HPO4,NACL) 3) Zniszczenie blony komórkowej, uwolnienie DNA: a)metoda fizyczna- kilkakrotne zamrażanie i rozmrażanie b)metoda chemiczna-degradacja za pomoca detergentów SDS,DTT, SARKOZYL,TRITON X-100, enzym lizostatyna 4) uwalnianie DNA z kompleksu- bialka histonowe dodajemy enzymy- proteinazy-kdlatego ze jest ono zwiazane z bialkami histanowymi 5) a) usuwanie bialek za pomoca chloroformu i fenolu b)zawieszanie DNA na kolumienkach na żelu sefadeksynowym c) za pomoca kulek magnetycznych tkanki żelowe otoczone tworzywem sztucznym na którym sa ligandy które wychwytuja DNA,RNA lub bialka 6)prebicytacja DNA z kolumienek lub kulek magnetycznych-gdy dzialamy fenolem lub chloroformem wytracanie alkoholem: gdy kolumienki wyplukiwane buforemTE: Tris,edta lub woda dejonizowana z kolumienek zalecane buforem bo dlużej można trzymac próbe. PRZECHOWYWANIE w probówkach, w buforze TE ,można poddac liofilizacji w postaci osadu: probówki musza być opisane:nr zwierzecia, data izolacji, steżenie. Przechowujemy w temp. lodówki- kilka dni do miesiaca +4C: w zamrażarce-25Ckilka miesiecy do 2 lat;-80C przechowujemy bardzo dlugo (glebokie mrożenie, próby należy podzielic).Wyizolowane DNA musimy poddac ocenie jakościowej ilościowej. Jakościowa-elrktroforetyczna a ilościowa metoda spektrofotometryczna. TECHNIKI ELEKTROFORETYCZNE: Elektroforeza- nazywamy ruch czast fazy rozproszonej dodazanych ładunkiem elektrycznym względem fazy rozproszonej pod wpływem przyłożonych z zew roznic potencjałów. Jej istota jest ruch czast naladowanych dodatnie lub ujemnie w roztworze buforowym (elektroforeza swobodna lub w nosniku może być bibula celuloza zel skrobiowy agarozowy) w polu elektrycznym. Jeśli ta mieszanian będzie w polu elek do bieguna + będą podążać czast – a do ujemnego +. ANAFOREZA- proces prowadzacy do przemieszczania się czast ujemnych. KATAFOREZA-proces przemieszczanie się czast + w kierunku elektrody ujemnej. BIALKA: sa obdarzone ładunkiem, ładunek bialek zalezy od pH roztworu w jakim znajduja się dla bialek charkt jest punkt izoelektryczny taka wartość ph w którym ładunek elek bialka jest rowny 0 Jeśli pH jest poniżej tego punktu to bialko ma ładunek dodatni. KW NUKELOTYDOWE: sa obdarzone laduniem ujemnym wynka to z obecności resz grup fosforanowych umieszczonych równomiernie wzdłuż calej czasteczki o jednakowej gęstości. Elektroforeza kw. Nukle. Przebiega w calym zakresie Ph. Kazda naladowana elekt. Czast. Charakteryzuje się ruchliwością elektroforetyczna – szybkością przemieszczania się czasteczek w polu elektrycznym. ELEKTROFOREZA – w 1806r. zaobserwowal Reuss Lodge w 1889r. opisali to zjawisko. W 1918r. Gałecki opisal to zjawisko teoretycznie. Po raz pierwszy wykorzystal 1937r. Tiselius, zbudowal on aparat do elektroforezy swobodnej. UKŁAD OPTYCZNY-pozwalal na pomira gęstości optycznej roztworu buforowego cieczy miedzy frakcjami i frekcji. W 1937r. Konig opisal technike na nosniku była nia bibula, substancja porowata w której jest bufor. Na paski bibuly nasaczone buforem naniesiono probki pod wpływem pola elektrycznego frakcje się rozchodzily. Po przeprowadzeniu elektroforezy pasek bibuly suszono a frakcje identyfikowano barwnikami np. czernia arnidowa. Technika ta nie znalazla szerszego zastosowania. W 1955r. Smitchies zamienil bibule na zel skrobiowy, uzywano barwnikow, ta technika rozdzielono bialka surowicy krwi i wytworzyly się prazki.
ZEL AGAROZOWY-polisacharyd izolowany glonokrasnorostow skl. Zelujacy latwo się rozpuszcza pod wpływem temp. Jest to struktura bardziej stabilna, rozdzielono ja na agarozie. Wielkość bialek wyraza się w Daltonach a kwasy nukleinowe liczba par zasad. Wieksza jednostka od par zasad jest kilo par zasad. SZYBKOSC CZASTECZEK KWASOW NUKLEINOWYCH ZALEZY OD: wielkości par zasad: 100 pz 150 pz 200 pz 800 pz , mieszanina poddana elektroforezie najszybciej wedrujaca to 100 pz najwolniej 800 pz. SZYBKOSC CZASTECZEK PAR BIALEK ZALEZY OD: ruchliwości elektroforetycznej, od konformacji czasteczek-formy przestrzenne: 1 forma 1000 pz super zwinięte DNA, 2 forma liniowa, 3 forma najszybciej wedrujaca forma super zwinieta pozniej liniowa ostanie OC. Zalezy od stężenia nosnika w roztworach b. stezoinych czasteczki mniejsze – szybciej, wieksze – wolniej. BUFOR OBCIAZAJACY-dodaje się po izolacji by probe dobrze umiejscowic w studzience. RODZAJA BUFOROW-1)TAE (kwas octowy PH = 8) ma zdolność do rozkladania się na elektrodach 2) TBE (kwas borowy) 3) TPE (kwas fosforowy). POLIMERAZY DNA: sa enzymami syntetyzującymi nowe polinukleotydy komplementarne do matrycy dna, nie mogą one rozpocząć syntezy gdy matryca jest wyłącznie jednoniciowa. Aby zapoczątkować reakcje polimeryzacji konieczne sa krotkie fragmenty dwuniciowe. NUKLEAZY: sa enzymami degradującymi czast dna poprzez niszczenie wiazanie fosfodiestrowego łączącego kolejne nukleotydy. Podzial: 1) Egzonukleazy- usuwaja nukleotydy z końców czast dna. 2) Endonukleazy- przecinaja wew wiazania fosfodiestrowe. LIGAZY: sa enzymami łączącymi czast dna dzieki wytwarzaniu wiązań fosfodiestrowych miedzy nukleotydami na koncach dwoch roznych czast dna lub zlepiana końców tej samej czasteczki. ENZYMY MODYFIKUJACE DNA: użyteczne sa na rozne sposoby; Fosfataza alkaliczna: usuwa reszty fosforowe z końców 5’dna co zapobiega ich wzajemnej ligacji. Kinaza polinukleotydowa- dodaje reszty fosforanowe do kancon 5’dna. TERMINALNA TRANSFERAZA DEOKSYNY POLINUKLEOTYDOWA: dodaje jeden nukleotyd do końców 3’dna. DWA RODZAJE ENZYMOW: restruktazy i metylazy. Rozpoznaja ten sam fragment dna przecinaja fragment dna to restruktazy a metylazy buduja ten sam fragment. Enzymy restrukcyjne znajduja się w bakteriach i sinicach. Smith i Natanson w 1973r utworzyli nazewnictwo bakterii np.: EcoRI escherichia coli. E- nazwa rodzajowa, co- nazwa gatunkowa, R- jeśli jest szczep lub senotyp, I- kolejny enzym z tej bakterii. KRYTERIA PODZIALU: mechaniz dzialania, produkt i substrat, kofaktory ( sub nieznedna do aktywacji enzymow). PODZIAL ENZYMOW NA KLASY: 1) zaliczamy takie enzymy które rozpoznaja charakterystyczne dla siebie sekwencje 2-niciowa dna, przecinaja to dna na odległość około 1000 por zasad jest ono nieprecyzyjne. Wymagaja 3 kofaktorow: dawka enerii ATP, obecności jonow magnezu, S-adenozylometioniny.2) enzymy restrukcyjne które rozpoznaja dla siebie charakterystyczne sekwencje która jest 4,6,8-nukletydowa, możemy mowic o enzymach czworkowych, szostkowych i osemkowych, ma ona właściwości polindromowe, ma os symetriiprzecinaja 2-niciowe dna wew rozpoznawalnej sekwencji otrzymujemy tzw tępe konce np. AC/CT, CG/CG i konce lepkie np. GCG/C, /GATC, G/GATCC. Za jedna jednostke aktywności enzymu restrukcyjnego uwaza się taka jego ilość która w temp 37C w ciagu 1 godz trawi 1 mikrogram dna fagolambda. 3) enzymy restrukcyjne rozpoznaja charakterystyczne sekwencje na 2-niciowym dna i przecinaja ta frekwencje na odległości dwoch par zasad jest ono precyzyjne i powtarzalne. Wymagaja kofaktorow: ATP, jonow magnezu i S-adenozylometioniny (niekonieczne). ZASTOSOWANIE ENZYMOW: tworzenie map restrukcyjnych genow, fragmentowanie dna, wyodrębnianie genow, sekwencjonowanie dna, ustalanie zgodności tkankowych, transplantologia, roznicowanie organizmow, rekombinacje i klonowanie, wykrywanie mutacji, analiza polimorfizmu długości fragmentow restrukcyjnych(RFLP).
WYKLADY: Wlaściwości fizykochemiczne DNA. Organizacja genów ( genom jadrowy, mitochondrialny, chloroplastowy, prokariotyczny, eukariotyczny) ROZWÓJ ORGANIZMÓW a) fizjilogiczny b) patologiczny. POGLADY DOTYCZACE ŻYCIA NA ZIEMI a)hipoteza samorództwa- życie powstaje z martwej materii np. myszy ze slomy b) hipoteza kreacjonistyczna-świat zostal stworzony w wyniku jednorazowego aktu stworzenia c) hipoteza penspermii d) teoria ewolucji. EWOLUCJA: a)ewolucja chemiczna-tworzenie z materii nieorganicznej zwiazków organicznych b) ewolucja biologiczna- preorganizm jednokomórkowy miał zdolnośc do samoodtwarzania się,oddychal beztlenowo, dal poczatek pro- i eukariotom c)ewolucje molekularne- replikacja DNA, synteza RNA i bialek organicznych. POWSTAWANIE POLINUKLEOTYDÓW mogą ulegac spontanicznej polimeryzacji przez reakcje kondensacji. RYBOZYM(RNA) wlaściwościach enzymatycznych (katabolitycznych), katalizuje zerwanie innej czasteczki RNA. Zerwanie lańcucha które eystepuje w przyrodzie w obrenie tej samej czasteczki, które zawiera rybozym stanowi etap replikacji genomu wirioda, może katalizowac swoja wlasna synteze. FUNKCJE RYBOZYMU: zrywanie RNA i DNA, ligacje RNA i DNA, tworzenie wiazań peptydowych podczas biosyntezy bialek, splicing RNA, polimeryzacja RNA, fosforylacja RNA, aminoacylacja RNA, alkilowanie RNA, izomeryzacja RNA. KOPIOWANIE czasteczek RNA we wczesnym świecie RNA zanim wyewoluwaly polimerazy RNA, rybonukleotydy lacza się z matryca RNA musialy polimeryzowac spontanicznie. Rybozym mógl wyewulowac tak, że spelnil funkcje katalityczna i kodujaca. Przeksztalcenie czasteczki RNA w przodkach pierwszego genomu DNA RNA JEST STARSZE OD DNA podstawa jest różnice cheniczne miedzy RNA a DNA: ryboza latwo powstala z aldehydy mrówkowego który jest jednym z podstawowych produktów otrzymywanych w eksperymentach stymulujacych warunki pierwotnej ziemi, deoksyryboza powst. z rybozy w reakcji katalizowanej przez bialkowy enzym. DNA LEPSZY MATERIAL DO TRWALEGO PRZECHOWYWANIA INF.GENETYCZNEJ NJŻ DNA: lańcuchy cukrowo-fosforowe DNA sa chemicznie bardziej stabilne niż lańcuchy DNA b) dwuniciowa helikalna struktura DNA i wykorzystane do jego budowy tyminy zamiast uracylu :wieksza stabilnośc DNA ulatwia procesy naprawcze , jeden z lańcuchów dwuniciowej czasteczka może slużyc jako matryca do naprawy uszkodzeń w drugim lańcuchu, naprawa efektów deaminacji cytozyny. CENTRALNY DOGMAT BIOLOGII MOLEKULARNEJ: DNA kopiowane na RNA a dalej na bialko zawsze tylko w jedna strone, przy czym RNA pelni funkcje pośrednika, niektóre ważne funkcje nadal sa katalizowane przez RNA co wydaje się pozostalościa pierwotnie istniejacego świata RNA. Wirusy a wśród nich retrowirusy u których inf. jest zapisana na RNA-wyjatek od CDBM wykryci odwrotnej transkrypcji. Dalsze korekta CDBM wykrycie prionów, których replikacje odbywa się na zasadzie przeplywy inf.genet. od bialka do bialka.
KWASY NUKLEINOWE lata 70 XIXw odkrycie kwasów nukleinowych. Z uwagi na ich zwiazek z jadrem i silni kwasowy charakter nazwano ja kwasami nukleinowymi. Miescher odkrywa kwasy nukleinowe w komórkach ropy Kossel odkrywa kw nukleinowe w kom grasicy. RNA- odkryto w tymonukleinowy kwas drożdzowy i nazwano drożdzowym kw nukleinowym Lata 30-50 XXw w nauce zaczyna dominowac przekonanie że to wlaśnie w DNA jrst zapisana inf genetyczna.1928-Griffith dwonka zapalenie pluc (pneumokoki,Diplococus) z dwóch szczepów S-choroba R-brak objawów 1931-Hammerling glon zielenica z rodzaju Acetabulania 1944-Averry,McLeod,McCARTY-powt. Doświadczenie Griffitha i Allowayea ale tym razem in vitro, stwierdzenie że czynnikiem transformujacym jest DNA 1950-51 Harshey i Chase fag T2 infekcji bakterie Escherichia coli. DOŚWIADCZENIE GRIFFITHA: szrup s kom wytwarzaja wielocukrowa otoczke, kolonie sa okragle i maja gladkie brzegi,szczep wirulentny. Szczep R- komórka nie wytwarza otoczki kolonie sa nierówne i maja poszarpane brzegi szczep niewirulentny wstrzykiwane myszom mieszanka żywych pneumokoków szczepu R oraz zabite szokiem termicznym bakterie szczepu S.TRANSFORMACJE: przekazywanie genow w formie rozpuszczonej lub wyekstrenowanego dna (doświadczenie Griffitha). Jest to nabywanie cech przez bakterie. TRANSDUKCJA: bierne przenoszenie materialu genetycznego z 1 kom do 2 za pośrednictwem bakteriofagi. KONIUGACJE: przekazywanie materialu genetycznego miedzy dwiema bakteriamii w drodze ich bezpośredniego kontaktu. KLASYCZNE DOSWIADCZENIE: Doświadczenie z 1946r Afery, Macleod i McCarty. Lewiński- 1945-51. Hammerling: odciecie gornej (pozbawionej jader) czesci komorki czyli „parasola” powodowalo jej obumieranie, „trzonek” jeśli miał jadro zawsze odtwarzal utracony parasol. Odcieto kom parasola, z trzonka usuniecie jadra kom i na to miejsce wprowadzenie jadra kom z charakterystycznym odmiennym kształtem. BAKTERIOFAGI: zbudowane sa z bialek i Dna, po zainfekowaniu bakterii bakteriofagiem T2 okazalo się ze fagi potomne zawieraly 32P lecz nie mialy 35P. HISTORIA JEDNEJ CZASTECZKI DNA- jest nosnikiem informacji genetycznej, Rosalind Franklin i James Watson Francis Crick, Meurice Wilkins, Edwin Chargraff. Początkowy ster wiedzy: Dna zbudowane jest z ogromnej liczby ułożonych jedna za druga czasteczek zwanych nukleotydami, istnieje 4 typy nukleotydow każdy złożony z 3 elementow: grupy fosforowej cukru oraz 1 z 4 zasad: adeniny cytozyny guaniny i tyminy. REGULY CHARGEFFA: A=T G=C Suma puryn A+G= sumie pirimidyn T+C. Nie wiedziano z ile nici sklada się czast dna z 1,2,3 czy 4 ale wiedziano jak te nici sa ułożone czy leza prosto przy sobie uwijaja się wokół siebie czy przybieraja jakas forme. Nie wiedziana gdzie leza zasady azotowe na zew czy wew nici. Większość uczonych przychylilo się do tezy ze pojedyncza czast dna jest trojniciowa helisą z zasadami azotowymi sterczącymi na zewnatrz. Ilość dna w jadrze kom jest wartością stala we wszystkich kom somatycznych organizmu w kom rozrodczych jest ona 2 razy mniejsza. Człowiek posiada kom somatycznych 6x10-12g.Wystepuja 2 formy dna: A-DNA, B-DNA. HELISA: krzywa rozpieta w przestrzeni dna jest helisa nie spirala bo spirala jest figura prosta lezaca w płaszczyźnie.
WYKLADY: Wlaściwości fizykochemiczne DNA. Organizacja genów ( genom jadrowy, mitochondrialny, chloroplastowy, prokariotyczny, eukariotyczny) ROZWÓJ ORGANIZMÓW a) fizjilogiczny b) patologiczny. POGLADY DOTYCZACE ŻYCIA NA ZIEMI a)hipoteza samorództwa- życie powstaje z martwej materii np. myszy ze slomy b) hipoteza kreacjonistyczna-świat zostal stworzony w wyniku je...
anetushek