Ćwiczenie nr 7
dr Mariola Krawiecka
Aminokwasy i białka
Repetytorium
1. Podział aminokwasów.
2. Właściwości aminokwasów-aminokwasy jako jony obojnacze.
3. Biologicznie ważne peptydy.
4. Leki o budowie aminokwasowej.
5. Struktura, podział i właściwości białek.
6. Biomedyczne znaczenie białek.
7. Trawienie i wchłanianie białek.
8. Choroby związane z zaburzeniami przemiany aminokwasów i białek.
9. Chromatografia bibułowa.
Część praktyczna
1. Reakcje charakterystyczne dla aminokwasów.
2. Wytrącanie, wysalanie białek.
3. Identyfikacja dwóch aminokwasów.
4. Chromatografia bibułowa aminokwasów.
Aminokwasami nazywamy związki zawierające w swej cząsteczce dwie charakterystyczne grupy funkcyjne: aminową – NH2 i karboksylową – COOH.
Aminokwasy są najmniejszymi elementami strukturalnymi białek, polipeptydów i peptydów we wszystkich organizmach żywych, od bakterii do człowieka tak więc
najważniejszą reakcją aminokwasów, z punktu widzenia biochemicznego, jest reakcja tworzenia wiązania peptydowego (amidowego). Reakcja ta nie przebiega jednak łatwo, gdyż stała równowagi przesunięta jest w kierunku hydrolizy wiązania peptydowego. Aby przeprowadzić syntezę wiązania peptydowego, jedna z grup karboksylowych musi być zaktywowana. Jednym ze sposobów laboratoryjnych jest przeprowadzenie grupy karboksylowej w chlorek kwasowy i kondensacja otrzymanego chlorku z grupą aminową drugiego aminokwasu. W przyrodzie aktywacja grupy karboksylowej zachodzi w wyniku kondensacji z ATP (powstaje aminoacyloadeninan) i następnie zachodzi kondensacja z grupą aminową drugiego aminokwasu.
Powstające wiązanie peptydowe jest planarne (płaskie). Dzięki stabilizacji rezonansowej ma częściowo charakter wiązania podwójnego, zatem zahamowana jest swobodna rotacja wokół wiązania C-N i występuje izomeria cis-trans. Trans- konfiguracja jest korzystniejsza energetycznie niż cis-konfiguracja i częściej występuje w łańcuchach peptydowych.
Usztywnienie wiązania peptydowego wpływa na kształtowanie struktury białek.
Aminokwasy występujące w białkach są kwasami a-aminokarboksylowymi o konfiguracji L. Wszystkie z wyjątkiem glicyny są czynne optycznie. Oprócz aminokwasów budujących białka istnieje oczywiście cała gama aminokwasów niebiałkowych, które odgrywają ważną rolę w wielu procesach biochemicznych zachodzących w żywych organizmach. Mogą być substratami w utlenianiu komórkowym, w syntezie różnorodnych związków biologicznie czynnych. Aminokwasy lub ich pochodne są neuroprzekaźnikami, neurohormonami lub klasycznymi hormonami.
Aminokwasy zatem spełniają następujące funkcje:
1) tworzenie białek- rola strukturalna, hormonalna i katalityczna,
2) uczestnictwo w różnorodnych funkcjach wewnątrzkomórkowych jak: przenoszenie
impulsów w układzie nerwowym, regulacja wzrostu komórkowego, biosynteza
porfiryn, puryn, pirymidyn i mocznika,
3) biosynteza antybiotyków polipeptydowych i substancji przeciwnowotworowych.
Istnieje około 20 podstawowych aminokwasów budujących białka. Wszystkie one posiadają własne kodony genetyczne warunkujące wbudowanie ich w łańcuch polipeptydowy. Olbrzymia różnorodność kombinacji połączeń aminokwasów warunkuje istnienie wielu białek, które to determinują olbrzymią ilość gatunków. Niewielka zmiana w kolejności połączenia aminokwasów powoduje zmiany w funkcji białka, stąd też olbrzymie zainteresowanie budową białek i możliwościami badania ich struktury. Aby określić kolejność aminokwasów stosuje się metody chemiczne:
1. Określenie rodzaju aminokwasów i ich ilości - hydroliza białka (kwasowa, zasadowa lub najczęściej enzymatyczna)
2. Częściowa hydroliza białka na peptydy i następnie:
a) oznaczanie N-końcowego aminokwasu,
b) oznaczanie C-końcowego aminokwasu.
3. Oznaczenie sekwencji aminokwasów
1. Podział aminokwasów
Ze względu na budowę łańcucha R aminokwasy zostały podzielone na siedem grup:
1. Aminokwasy alifatyczne obojętne: glicyna (Gly), alanina (Ala), walina (Val),
leucyna (Leu), izoleucyna (Ile)
2. Aminokwasy alifatyczne- hydroksyaminokwasy: seryna (Ser), treonina (Thr)
3. Aminokwasy zawierające siarkę: cysteina (Cys), cystyna (Cys-Cys),
metionina (Met)
4. Iminokwasy : prolina (Pro), hydroksyprolina (Hyp)
5. Aminokwasy zasadowe: lizyna (Lys), hydroksylizyna (Hyl), arginina (Arg),
histydyna (His)
6. Aminokwasy kwaśne i ich monoamidy: kwas asparaginowy (Asp), asparagina
(Asn), kwas glutaminowy (Glu), glutamina (Gln)
7. Aminokwasy aromatyczne i heteroaromatyczne: fenyloalanina (Phe),
tyrozyna (Tyr), tryptofan (Trp)
Natura łańcuchów bocznych jest odpowiedzialna za właściwości fizykochemiczne aminokwasów stąd też dzielimy aminokwasy na
1. aminokwasy hydrofobowe
2. aminokwasy polarne
a). obdarzone ładunkiem
b). pozbawione ładunku
Ze względu na zapotrzebowanie aminokwasów przez organizm zwierzęcy aminokwasy można podzielić na :
Aminokwasy egzogenne - niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu zwierzęcego, ale nie wytwarzane przez ten organizm. Muszą być dostarczane z zewnątrz wraz z pokarmem.
Dla organizmu człowieka są to: walina, leucyna, izoleucyna, lizyna, fenyloalanina, metionina, treonina, tryptofan, arginina, histydyna (niezbędna dla dzieci do 12 lat).
Aminokwasy endogenne - niezbędne do prawidłowego funkcjonowania organizmu i wytwarzane przez ten organizm.
Dla organizmu człowieka są to: glicyna, alanina, seryna, cysteina, tyrozyna, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy, hydroksyprolina, asparagina, glutamina, prolina.
Bardzo ważny dla prawidłowego funkcjonowania organizmu jest odpowiedni dobór diety bogatej w aminokwasy egzogenne, jeśli zabraknie choć jednego aminokwasu egzogennego pozostałe aminokwasy, choć dostarczane w odpowiedniej ilości, nie są całkowicie wykorzystywane przez organizm. Mówiąc o odpowiedniej diecie mamy oczywiście na myśli dobór odpowiedniej diety białkowej, gdyż to białka są dla organizmu głównym źródłem aminokwasów.
Nadmierne zaś ilości białek, a zatem i aminokwasów, w odróżnieniu od lipidów i cukrów, nie są magazynowane. Aminokwasy, które nie zostały bezpośrednio wbudowane w białko ulegają dezaminacji. Azot zostaje usunięty z organizmu w postaci mocznika, a łańcuchy węglowe są wykorzystywane do biosyntezy tłuszczów i węglowodanów.
2. Właściwości aminokwasów- jony obojnacze
Cząsteczka aminokwasu w roztworze wodnym występować może w jednej z trzech postaci:
1 2 3
Przewaga odpowiedniej postaci aminokwasu zależy od pH roztworu.
Wzory aminokwasów białkowych
3. Biologicznie ważne peptydy
Aminokwasy tworzą wiele oligopeptydów i polipeptydów odgrywających ważne funkcje w żywych organizmach np.: glutation (g-glutamylocysteinyloglicyna, tripeptyd H-g-Glu-Cys-Gly-OH, odgrywa zasadniczą rolę w procesach utleniania i redukcji dzięki obecności grup –SH), angiotensyna II (hormon tkankowy o budowie oktapeptydu H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH, zwęża naczynie krwionośne i jest najsilniejszym czynnikiem podwyższającym ciśnienie krwi, nasila uwalnianie noradrenaliny), bradykinina (hormon tkankowy o budowie nonapeptydu H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH, obniża ciśnienie krwi-zatem działa antagonistycznie do angiotensyny, odpowiedzialna jest również za uczucie bólu, który towarzyszy uszkodzeniu (zranieniu) skóry), oksytocyna (nonapeptyd, hormon tylnego płata przysadki, działa na system mięśni gładkich, zwłaszcza macicy ciężarnej, wywołuje wydzielanie mleka z gruczołów sutkowych w okresie karmienia), wazopresyna (hormon tylnego płata przysadki, nonapeptyd (hormon antydiuretyczny, ADH) zwiększa wchłanianie zwrotne w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobór ADH powoduje moczówkę prostą), gramicydyna S (antybiotyk działający na bakterie Gram-dodatnie, stosowany w leczeniu oparzeń, owrzodzeń, zakażonych ran), substancja P (neurohormon zbudowany z 11 reszt aminokwasowych, bierze udział w przewodzeniu bodźców bólowych), glukagon (hormon zbudowany z 29 reszt aminokwasowych, jest antagonistą insuliny, zwiększa stężenie glukozy we krwi), endorfiny i enkefaliny (grupa oligo- i polipeptydow wyodrębnionych z przysadki mózgowej), insulina (hormon wytwarzany przez komórki b-trzustki, zmniejsza stężenie glukozy we krwi, stosowana w leczeniu cukrzycy) itd.
Antybiotyki peptydowe są głównie produktami metabolizmu mikroorganizmów. Często są one odporne na działanie enzymów proteolitycznych, znajdujących się w normalnych komórkach. Przyczyną tego jest nie tylko cykliczna budowa tych antybiotyków, ale także występujące w ich łańcuchach peptydowych, mało spotykane w białkach, elementy strukturalne, takie jak D-aminokwasy, rzadkie aminokwasy i nie peptydowe wiązania między resztami.
Do grupy leków aminokwasowych zaliczyć można penicyliny. Cząsteczka penicyliny jest produktem cyklizacji dwóch aminokwasów: L-cysteiny i D-waliny. Poszczególne penicyliny różnią się od siebie tylko resztą R, którą w przypadku najbardziej znanego antybiotyku z tej grupy jest reszta benzylowa.
penicylina
5. Struktura, podział i właściwości białek
Struktura drugorzędowa - opisuje konformacje łańcuchów (helikalną i pofałdowaną) powstałe w wyniku utworzenia wiązań wodorowych między grupami karbonylowymi i amidowymi głównego łańcucha polipeptydowego oraz mostków disulfidowych.
Struktura trzeciorzędowa określa trójwymiarowe pofałdowanie danego łańcucha polipeptydowego wywołane wewnątrzcząsteczkowym oddziaływaniem łańcuchów bocznych. Strukturę tą stabilizują wiązania wodorowe, mostki disulfidowe i siły van der Waalsa.
Struktura czwartorzędowa - pojęcie to obejmuje występujące w wielu białkach asocjacje monomerów białkowych o oddzielnej strukturze drugo- i trzeciorzędowej w kompleksy oligomeryczne. Asocjacja i agregacja zachodzi w wyniku oddziaływań między polarnymi, zjonizowanymi i niepolarnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów, są to oddziaływania: dyspersyjne, hydrofobowe, jonowe, wodorowe, w kilku wypadkach stabilizacja dzięki mostkom disulfidowym. Przykładami białek o strukturze czwartorzędowej są hemoglobina, wirus mozaiki tytoniowej, dehydrogenaza białczanowa, dehydrogenaza alkoholowa.
Podział białek
Ze względu na różnorodność budowy białek trudno dokonać ścisłej klasyfikacji białek. Najstarszy podział białek oparty został na różnicach w rozpuszczalności białek i kształcie cząsteczek.
Wyróżnia się białka:
1) fibrylarne - o strukturze włóknistej, nierozpuszczalne w wodzie
2) globularne – o strukturze kulistej, rozpuszczalne w wodzie i roztworach soli
nieorganicznych. Dzieli się je na białka proste (zbudowane tylko
z aminokwasów) i białka złożone (zawierają grupy niebiałkowe jak cukry,
tłuszcze, kwasy nukleinowe, reszty kwasu fosforowego, jony metali).
1. Mają charakter wielkocząsteczkowy ( białka nie dializują ale ich roztwory wykazują cechy koloidów).
2. Wywierają ciśnienie koloidoosmotyczne.
3. Wędrują w polu elektrycznym (elektroforeza).
4. Ulegają wysalaniu ( (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl).
5. Skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo.
6. Pochłaniają światło przy 280 nm ( Trp i Tyr ).
7. Wykazują duży współczynnik załamania światła (oznaczanie białka metodą refraktometryczną).
8. Są wrażliwe na podwyższoną temperaturę i inne czynniki denaturujące.
Właściwości chemiczne białek
kation białkowy białkowy jon obojnaczy anion białkowy
pH<pI pI pH>pI
-nadmiar ładunku - rozpuszczalność i hydratacja -nadmiar ładunku
dodatniego minimalne ujemnego
-wzrost rozpuszczalności - brak wędrówki w polu -wzrost
i hydratacji elektrycznym rozpuszczalności
...
Rainhardt