Zastosowanie mikromacierzy DNA w genomice strukturalnej i funkcjonalnej.pdf

PRACE PRZEGL¥DOWE

Zastosowanie mikromacierzy DNA

w genomice strukturalnej

i funkcjonalnej

Agnieszka ¯mieñko 1 , Luiza Handschuh 1,2 , Micha³ Góralski 1 ,

Marek Figlerowicz 1

1 Centrum Doskona³oœci CENAT, Instytut Chemii Bioorganicznej,

Polska Akademia Nauk, Poznañ

2 Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Krwi,

Uniwersytet Medyczny im. K. Marcinkowskiego, Poznañ

DNA microarrays in structural and functional genomics

Summary

DNA microarrays or DNA chips were introduced in the middle nineties and

have developed as a very powerful tool for structural and functional analysis of

genomes. With thousands to millions of probes deposited on each microarray,

it is now possible to perform various kinds of analysis on the genome-wide

scale. The basic use of microarrays is gene expression profiling. For this pur-

pose, both one- and two-color labeling methods are used. More sophisticated

DNA microarrays allow for analyzing alternative splicing, DNA-protein interac-

tions, chromatine modifications and many more. Currently, DNA microarrays

represent an indispensable tool in biology and medicine.

Adres do korespondencji

Agnieszka ¯mieñko,

Instytut Chemii

Bioorganicznej,

Polska Akademia Nauk,

ul. Noskowskiego 12/14,

61-704 Poznañ;

e-mail:

akisiel@ibch.poznan.pl

Key words:

gene expression profiling, microarrays, DNA chips, array CGH, ChIP on chip,

alternative splicing.

1. Wprowadzenie

Pierwsze mikromacierze DNA (tzw. chipy DNA) wyprodukowa-

no na pocz¹tku lat 90. ubieg³ego wieku jako potencjalne narzê-

dzie do sekwencjonowania DNA, detekcji mutacji i mapowania

genomów (1,2). Sk³ada³y siê one z wielu bardzo krótkich (8-9 nt)

4 (83) 39–53 2008

Agnieszka ¯mieñko i inni

oligomerów syntetyzowanych in situ na plastikowej p³ytce. Poniewa¿ zarówno se-

kwencja poszczególnych oligomerów jak równie¿ ich lokalizacja na p³ytce by³a zna-

na, mog³y one pe³niæ rolê sond w reakcji hybrydyzacji z mieszanin¹ DNA (próbk¹

biologiczn¹) o nieznanej strukturze pierwszorzêdowej. Detekcjê produktów hybry-

dyzacji umo¿liwi³o fluorescencyjne znakowanie próbki i skanowanie p³ytki za po-

moc¹ czytnika laserowego.

Mikromacierze DNA zyska³y ogromn¹ popularnoœæ, gdy okaza³o siê, ¿e mo¿na je

stosowaæ tak¿e do badania profilu ekspresji genów (3-7). Fakt ten znajduje swoje

odzwierciedlenie w rosn¹cej liczbie publikacji deponowanych rokrocznie w bazach

danych. Przeszukiwanie bazy czasopism PubMed ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov )wy-

ra¿eniem microarray gene expression daje aktualnie blisko 20 tys. trafieñ, podczas gdy

samo s³owo microaray pojawia siê w tytule b¹dŸ streszczeniu ponad 26 tys. pu-

blikacji.

W ostatnich latach zaobserwowaæ mo¿na szczególnie dynamiczny rozwój ró¿ne-

go typu technologii dzia³aj¹cych na bazie mikromacierzy DNA. Wynika on nie tylko

z miniaturyzacji i automatyzacji procesu produkcji mikromacierzy, ale przede

wszystkim z poszerzania zakresu ich stosowania. Rozleg³oœæ tego zagadnienia spra-

wia, ¿e nawet pobie¿ne omówienie wszystkich sposobów wykorzystania mikroma-

cierzy DNA w jednej pracy przegl¹dowej jest niezwykle trudne. Celem artyku³u jest

zatem jedynie zapoznanie Czytelników z podstawowymi wariantami mikromacierzy

DNA, które – zdaniem autorów – odgrywaj¹ szczególne znaczenie w rozwoju bio-

logii i medycyny.

2. Analiza ekspresji genów koduj¹cych bia³ka

Do badania profilu ekspresji genów zasadniczo stosuje siê trzy typy mikromacie-

rzy, ró¿ni¹ce siê rodzajem sond, a w konsekwencji procedur¹ znakowania i hybrydy-

zacji próby oraz sposobem analizy wyników (tab.). Jako sondy stosowane s¹: krótkie

oligonukleotydy (18-25 nt), d³ugie oligonukleotydy (50-70 nt) lub dwuniciowe cDNA,

o d³ugoœci od kilkuset do kilku tysiêcy par zasad (8-20).

Sondy cDNA to najczêœciej produkty reakcji PCR, podczas gdy d³ugie oligonukle-

otydy uzyskuje siê na drodze syntezy chemicznej. Oba rodzaje sond nanosi siê za

pomoc¹ drukarki do mikromacierzy na p³ytkê szklan¹ lub plastikow¹ (zazwyczaj jest

to standardowe szkie³ko mikroskopowe pokryte reaktywn¹ pow³ok¹ chemiczn¹, za-

pewniaj¹c¹ efektywne wi¹zanie DNA) (11,17,18,21,22). Na pojedynczej drukowanej

mikromacierzy analizuje siê jednoczeœnie dwie próbki – badan¹ i kontroln¹, wy-

znakowane dwoma ró¿nymi barwnikami fluorescencyjnymi (znakowanie dwukolo-

rowe) (8). Na mikromacierzach tego typu jednemu genowi odpowiada zazwyczaj

jedna sonda. W odró¿nieniu od nich mikromacierze z³o¿one z krótkich oligonukle-

otydów zawieraj¹ zestawy kilku/kilkunastu sond reprezentuj¹cych dany gen, a ka¿-

d¹ z próbek znakuje siê identycznym barwnikiem i hybrydyzuje z inn¹ macierz¹

PRACE PRZEGL¥DOWE

Zastosowanie mikromacierzy DNA w genomice strukturalnej i funkcjonalnej

Tabela

Porównanie mikromacierzy DNA

Mikromacierze oligonukleotydowe

(chipy) o krótkich sondach (18-25 nt)

Mikromacierze oligonukleotydowe

o d³ugich sondach

(50-70 nt)

Mikromacierze cDNA

(sondy o d³ugoœci kilkuset – kilku tys. pz)

– najwy¿sza specyficznoœæ (wykrywanie

pojedynczych niesparowañ)

– synteza sond

– niekonieczna znajomoœæ sekwencji

ca³ego genomu

– niski koszt eksperymentu

– mo¿liwa równoleg³a analiza dwóch próbek (badanej i kontrolnej) na jed-

nej macierzy

– prosta procedura znakowania i odmywania

– du¿a elastycznoœæ – mo¿liwoœæ w³asnorêcznego zaprojektowania i przy-

gotowania mikromacierzy

– du¿a powtarzalnoœæ

– jednoniciowe sondy (zbêdna denaturacja, ograniczenie tworzenia struk-

tur drugorzêdowych)

– dostêpnoœæ wielu komercyjnych mikromacierzy, zw³aszcza dla znanych

genomów (organizmów modelowych)

– bardzo wysoki koszt

– bardziej z³o¿ona procedura odmywa-

nia po hybrydyzacji

– brak mo¿liwoœci bezpoœredniego po-

równania dwóch prób (na jednej mi-

kromacierzy)

– skomplikowana analiza wyników

(sondy PM/MM, wiêcej danych)

– wysoki koszt

– trudnoœci w znalezieniu uni-

katowych sekwencji w genomie

– du¿y wp³yw sk³adu nukleotydo-

wego sond na proces hybrydy-

zacji

– prawdopodobieñstwo wyst¹pienia hy-

brydyzacji krzy¿owej

– niezbêdna matryca biologiczna do syn-

tezy sond

– czasoch³onne przygotowanie sond

– wiêcej mo¿liwoœci wprowadzenia b³êdów

(PCR)

– problemy z powtarzalnoœci¹

– dwuniciowe sondy (koniecznoœæ dena-

turacji, kompetycja wi¹zania)

– konieczna znajomoœæ sekwencji docelowych

– skomplikowany proces projektowania sond

jednokolorowy:

jedna próba na mikromacierzy (np.

biotynylowany cRNA, znakowany po hy-

brydyzacji streptawidyn¹ sprzê¿on¹

z fluoroforem)

dwukolorowy:

cDNA z prób badanej i kontrolnej na jednej macierzy, ale wyznakowane in-

nymi fluoroforami (np. Cy3 i Cy5)

znakowanie próby odbywa siê przed hybrydyzacj¹, metod¹ bezpoœredni¹

(w trakcie procesu odwrotnej transkrypcji) lub poœredni¹ (najczêœciej po-

przez aminoallylonukleotydy)

– detekcja SNP i mutacji

– (re)sekwencjonowanie

– rozró¿nienie pomiêdzy genami ho-

mologicznymi

– znajdowanie nowych genów

– wyszukiwanie wiêkszych aberracji geno-

mowych (macierze CGH)

– badania ekspresji genów organizmów

o nieznanej sekwencji

– hybrydyzacja miêdzygatunkowa (CSH)

– analizy z zastosowaniem mikromacierzy dachówkowych (identyfikacja

wariantów splicingowych, ChIP-chip, macierze CGH)

– identyfikacja ma³ych regulatorowych RNA

BIOTECHNOLOGIA 4 (83) 39-53 2008

– wysoka specyficznoœæ

– prosta synteza (chemiczna)

sond i ich oczyszczanie

(ominiêcie eta-

pów oczyszczania i nanoszenia sond

na pod³o¿e)

in situ

Agnieszka ¯mieñko i inni

– profilowanie ekspresji genów

– identyfikacja mikroorganizmów patogennych

– diagnostyka molekularna (patrz Handschuh i wsp., w tym zeszycie „Biotechnologii”)

– farmakologia i farmakogenomika (odkrywanie i testowanie leków, monitorowanie terapii)

(znakowanie jednokolorowe) (8). Typowym przyk³adem takich mikromacierzy s¹

chipy DNA firmy Affymetrix (ang. GeneChips )( http://www.affymetrix.com ) (7,11). Wy-

korzystywana do produkcji chipów DNA technologia syntezy oligonukleotydów in

situ z zastosowaniem fotolitografii pozwala na gêstsze upakowanie sond ni¿ w przy-

padku mikromacierzy drukowanych. Pierwsza mikromacierz wysokiej gêstoœci sk³a-

da³a siê z 65 tysiêcy sond o d³ugoœci 20 nt (300 sond na gen), umieszczonych na po-

wierzchni zaledwie 1,6 cm 2 (3). Obecnie Affymetrix produkuje chipy, w których na

powierzchni 1 cm 2 mieœci siê ponad szeœæ milionów sond (23).

Alternatyw¹ dla mikromacierzy „statycznych”, zawieraj¹cych sondy immobilizo-

wane na szkie³ku, s¹ tzw. mikromacierze przep³ywowe, inaczej dynamiczne (ang.

bead arrays, microfluidic system, flow-through technology ), w przypadku których po-

szczególne sondy DNA zakotwiczone s¹ na p³ywaj¹cych swobodnie w roztworze

ziarnach (najczêœciej kuleczkach silikonowych lub polistyrenowych) o œrednicy kilku

m (24-30). W klasycznym podejœciu, prezentowanym przez firmê Luminex, w celu

odró¿nienia od siebie poszczególnych ziaren – noœników specyficznych sekwencji

oligonukleotydowych, ka¿de z nich wysyca siê unikatow¹ mieszanin¹ dwóch barw-

ników fluorescencyjnych (np. czerwonego i pomarañczowego zestawionych w od-

powiedniej proporcji). Trzeci barwnik (np. zielony), tzw. reporter, s³u¿y do znako-

wania badanej próbki biologicznej. Identyfikacja ziaren odbywa siê w cytometrze

przep³ywowym w oparciu na pomiarze emisji barwników klasyfikacyjnych. Równo-

czeœnie przyjmuje siê, ¿e intensywnoœæ sygna³u pochodz¹cego od barwnika reporte-

rowego jest proporcjonalna do iloœci sekwencji docelowej zwi¹zanej z sond¹

( http://www.luminexcorp.com/technology/index.html ) (24,28). W rozwi¹zaniach pro-

ponowanych przez inne firmy, op³aszczone sondami ziarna umieszcza siê w trójwy-

miarowych mikrokana³ach czy mikrokomorach (firmy Metrigenix, Febit, dawniej tak-

¿e Xeotron) (31) lub w tzw. wirtualnych naczyniach ( ang. virtual flasks ) – zdefinio-

wanej przestrzeni wokó³ mikroelektrod (firma CombiMatrix) (23). Do identyfikacji

ziaren stosuje siê równie¿ separatory magnetyczne i elektromagnetyczne (31).

Na wypuk³ej powierzchni ziarna mo¿na zmieœciæ znacznie wiêcej cz¹steczek

kwasu nukleinowego ni¿ na p³askim szkie³ku, co zwiêksza efektywnoœæ hybrydyza-

cji. Do zalet technologii mikroprzep³ywowych zalicza siê równie¿ minimalizacjê ry-

zyka wyst¹pienia hybrydyzacji krzy¿owej, znacznie krótszy czas trwania i ni¿szy

koszt samego eksperymentu (ziarna s¹ wielokrotnego u¿ytku) (24,26). Wad¹ jest

mo¿liwoœæ pojawienia siê w roztworze niepo¿¹danych interakcji pomiêdzy ró¿nymi

PRACE PRZEGL¥DOWE

Zastosowanie mikromacierzy DNA w genomice strukturalnej i funkcjonalnej

sondami. Ponadto maksymalna liczba ziaren, które mo¿na rozró¿niæ w cytometrze

przep³ywowym jest ograniczona do kilkuset (ok. 500), co sprawia, ¿e trudno jest im

konkurowaæ z klasycznymi mikromacierzami na szkie³ku ( http://arrayit.blogspot.

com/2007/08/microarray-versus-luminex-bioplex.html ). Jednak¿e obie technologie

s¹ wci¹¿ udoskonalane (11,26,27,31) i ka¿da z nich ma swoich zwolenników.

Rozwi¹zanie kompromisowe ³¹cz¹ce zalety mikromacierzy wysokiej gêstoœci

i korzyœci p³yn¹ce z zastosowania ziaren silikonowych jako noœników sond oligonu-

kleotydowych wprowadzi³a firma Illumina (technologia BioArray, http://www.illumi-

na.com ). Sondy o d³ugoœci 50 nt (ang. capture sequence ) zakotwiczone s¹ za pomoc¹

krótkiego ³¹cznika (ang. address sequence ) w ziarnach o œrednicy ok. 3 m. Ka¿de

ziarno, pokryte setkami tysiêcy kopii jednej sondy, umieszczone jest w do³ku na

p³ytce silikonowej (tzw. Bead Chip ) dziêki wykorzystaniu si³ van der Waalsa. Od-

leg³oœæ pomiêdzy ziarnami nie przekracza 6 m, co sprawia, ¿e na p³ytce o wymia-

rze szkie³ka mikroskopowego mieœci siê szeœæ identycznych macierzy reprezen-

tuj¹cych 20-50 tysiêcy genów ka¿da. Pozwala to na jednoczesne przeprowadzenie

kilku eksperymentów, co znacznie redukuje ich koszt. Jedna z odmian mikromacie-

rzy Illuminy (DASL) przeznaczona jest do badania profilu ekspresji genów w czêœcio-

wo zdegradowanych próbkach RNA, jakie wyekstrahowaæ mo¿na z tkanek zakonser-

wowanych formalin¹ i zatopionych w parafinie.

Niezale¿nie od rodzaju platformy stosowanej do analizy ekspresji genów, w re-

zultacie otrzymujemy zestaw danych liczbowych, które po odpowiedniej obróbce

(Stêpniak i wsp., w tym numerze „Biotechnologii”) odzwierciedlaj¹ poziom ekspre-

sji genów w badanej próbce biologicznej (rys. 1). Jednak specyficzne cechy poszcze-

gólnych platform mikromacierzowych, w po³¹czeniu z ró¿norodnoœci¹ protoko³ów

znakowania i hybrydyzacji oraz algorytmów stosowanych do normalizacji i analizy

danych, s¹ czêsto Ÿród³em niezgodnoœci pomiêdzy wynikami publikowanymi w ró¿-

nych laboratoriach. Faktycznie pierwsze porównania analiz mikromacierzowych wy-

konanych z zastosowaniem ró¿nych platform nie by³y optymistyczne (9). Jednak¿e

postêp w rozwoju samej technologii, automatyzacja eksperymentu, standaryzacja

protoko³ów, zwiêkszenie liczby analizowanych prób oraz profesjonalna obróbka da-

nych prowadz¹ do tego, ¿e rezultaty analiz tych samych próbek RNA otrzymane na

ca³kiem ró¿nych macierzach mog¹ byæ porównywalne (32).

3. Badanie alternatywnego sk³adania transkryptów

Alternatywne sk³adanie transkryptów, AS (ang. alternative splicing ), jest to proces

umo¿liwiaj¹cy powstawanie ró¿nych wariantów mRNA z tej samej cz¹steczki pre-

kursorowej (pre-mRNA). Obecnie szacuje siê, ¿e transkrypty oko³o 70–80% genów

ludzkich podlegaj¹ alternatywnemu sk³adaniu (33-35), co oznacza, i¿ s¹ one Ÿród-

³em dwóch lub wiêkszej liczby mRNA. Zjawisko to jest tak¿e stosunkowo powszech-

ne u mniej z³o¿onych organizmów, np. u muszki owocowej dotyczy ok. 40% trans-

BIOTECHNOLOGIA 4 (83) 39-53 2008

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: