IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.pdf

IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab6.html

IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DA.

Izolacja z żelu jest niezbędnym etapem w szeregu doświadczeń. Jest konieczna gdy po

rozdziale pragniemy wykorzystać do dalszej pracy pewną określoną frakcję materiału

lokującego się w odpowiednim prążku.

Istnieje wiele metod odzyskiwania DNA z żeli jednak żadna z nich nie jest

pozbawiona wad.

Istotne problemy przy izolacji to :

obecność inhibitorów reakcji enzymatycznych np. obecne w agarozie

zanieczyszczenia w postaci polisacharydów , które hamują aktywność enzymów

używanych przy dalszej obróbce klonowanego DNA

niezbyt duża skuteczność odzyskiwania dużych fragmentów DNA ponieważ

wydajność izolowania jest funkcją ciężaru cząsteczkowego tych fragmentów , za

wielkość graniczną dla dobrej izolacji przyjmuje się długość 5 kb

im mniejsza ilość DNA na żelu tym mniejsza wydajność jego odzyskiwania , izolacja

staje się nieskuteczna przy ilościach mniejszych niż 500 ng

nie ma możliwości izolacji jednocześnie kilku fragmentów o różnej długości.

Metody :

1. Izolacja DA z użyciem DEAEcelulozy.

Polega na przyczepieniu się migrującego DNA do umieszczonej w żelu membrany z

DEAEcelulozą , którą następnie odpłukuje się z zanieczyszczeń buforem o niskiej

sile jonowej a potem eluuje z niej DNA buforem o wysokiej sile jonowej. Należy

pamiętać , że z membran nie podlega elucji jednoniciowe DNA oraz fragmenty

powyżej 15 kb.

2. Elektroelucja do woreczków dializacyjnych.

Najefektywniejsza do izolacji dużych fragmentów DNA powyżej 5 kb. Po

odpowiednim rozdzieleniu wycina się konkretny prążek DNA , umieszcza w

woreczku dializacyjnym , który wkłada się do aparatu do elektroforezy i prowadzi ją

przez jakiś czas po czym na krótko odwraca się bieguny i prowadzi elektroforezę

1 z 2

20100404 13:26

IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA.

http://zguw.ibb.waw.pl/%7Eknbm/bmwi/podrek/lab/lab6.html

przez minutę co pozwala na uwolnienie DNA ze ścian woreczka. Woreczek

dializacyjny zostaje przepłukany odpowiednim buforem i po dodaniu kilku

specjalnych odczynników i wirowaniu otrzymujemy preparat DNA.

3. Metoda "freezesqeeze".

Jest to bardzo szybka metoda izolacji. Tak jak poprzednio po elektroforezie zostaje z

żelu wycięty konkretny prążek. Fragment żelu umieszczony w probówce , na dnie

której znajduje się niewielka ilość silikonowej szklanej waty , zamraża się w ciekłym

azocie (freeze) a następnie wkłada się jedną probówkę w drugą po zrobieniu w tej

pierwszej niewielkiego otworku na dnie. Kolejnym etapem jest wirowanie (sqeeze).

Uzyskany w ten sposób bufor poddaje się jeszcze kilku zabiegom wytrącania i

wirowania , po których otrzymujemy wyizolowane DNA.

ELEKTROFOREZA WĘDRÓWKA W ŻELU

SEKWENCJONOWANIE SĄ JUŻ DO TEGO MASZYNY

2 z 2

20100404 13:26

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: