Walidacja metod analitycznych. cz.3.pdf

LABORATORIUM 9/2009 | ... W LABORATORIUM

Walidacja metod

analitycznych – cz. III

STRESZCZENIE Dobrze zwalidowana

metoda analityczna jest kartą przetargową

wielu laboratoriów komercyjnych stosujących

metody nieznormalizowane lub metody

znormalizowane, ale zmodyﬁ kowane.

Niekiedy czas przeprowadzanego procesu

walidacji odgrywa bardzo ważną rolę

w pozyskiwaniu klientów. Stąd bardzo

ważne jest dobranie odpowiednich

parametrów walidacji, koniecznych

i wystarczających do stwierdzenia, czy

dana metoda jest właściwa do określonego

zastosowania analitycznego. Artykuł jest

ostatnią częścią zamykającą omówienie

poszczególnych parametrów wyznaczanych

w trakcie walidacji metod analitycznych.

SŁOWA KLUCZOWE walidacja

metod analitycznych, metoda

analityczna, dokładność, precyzja,

niepewność, stabilność

stopień zgodności między wyni-

kiem uzyskanym na drodze analiz

metodą walidowaną a wartością, która jest

akceptowana jako prawdziwa (rzeczywista).

W międzynarodowej normie ISO 5725

do opisu tego parametru stosuje się dwa

terminy: poprawność i precyzję (1). Po-

prawność związana jest ze zgodnością

pomiędzy średnią arytmetyczną z dużej

liczby pojedynczych wyników badania

a wartością prawdziwą lub też przyjętą war-

tością odniesienia (2). Precyzja natomiast

jest miarą zgodności pomiędzy wynikami

badania (2). W normie PN-ISO 5725-

-1:2002 (1) zostało wyraźnie podkreślone,

że termin „dokładność” wcześniej był

utożsamiany z poprawnością. Jest jednak

oczywiste, że dokładność musi być związana

z brakiem rozbieżności między wynikami

badania a przyjętą wartością odniesienia,

a więc z wysoką precyzją metody.

O poprawności metody można mówić

wtedy, gdy jest sens mówić o prawdziwej

wartości mierzonej wielkości. Mimo że

podczas stosowania niektórych metod

analitycznych nie jest znana wartość

prawdziwa, możliwe jest przyjęcie warto-

ści odniesienia dla mierzonej wielkości.

Dzieje się tak, gdy dostępne są materiały

odniesienia (materiały, których wartość

mierzonej wielkości jest dokładnie znana)

lub też gdy przyjętą wartość odniesienia

można uzyskać, stosując inną metodę,

a także wykorzystując specjalnie przy-

gotowaną próbkę o znanych właściwo-

ściach (1). Miarą poprawności jest obcią-

żenie, czyli różnica pomiędzy wartością

oczekiwaną badania a przyjętą wartością

odniesienia.

Dokładność metody analitycznej de-

finiowana jest jako różnica Δ x met między

wartością oczekiwaną E(x) zbioru wyników

uzyskanych daną metodą a prawdziwą za-

wartością danego analitu μ x . Wartość tej

różnicy jest równa wartości błędu systema-

tycznego, ponieważ wartość oczekiwana

zbioru wyników uzyskanych daną metodą

E(x) jest definiowana jako E(x) = μ x + Δ x syst .

Dostajemy zatem wyrażenie [1]:

def

( [1].

Wartość bezwzględna błędu systema-

tycznego  Δx syst  jest więc miarą niedo-

kładności metody analitycznej. Wynika

stąd, że metoda dokładna jest obarczo-

na pewnym błędem systematycznym

( Δ x syst  ), jego wartość jest bliska zeru,

natomiast metoda niedokładna charakte-

ryzuje się dodatnim lub ujemnym błędem

systematycznym ( Δ x syst  ) (1).

)

met

syst

POPRAWNOŚĆ

A PRECYZJA METODY

Poprawność nie zawsze idzie w parze z pre-

cyzją metody; ilustracją tego zjawiska jest

rys. 1 (str. 40) (3). Przedstawione zostały

na nim wyniki pomiarów dla czterech me-

tod analitycznych różniących się ze wzglę-

du na te dwa parametry. Metoda I jest

poprawna i precyzyjna, ponieważ rozrzut

uzyskanych wyników jest mały, a ich wartość

średnia leży w pobliżu wartości prawdziwej.

Metoda II jest obrazem analizy wykonanej

z dużą precyzją, ale niepoprawnie, zaś me-

toda III wykonana jest poprawnie, ale jest

nieprecyzyjna. Metoda IV jest niepoprawna

oraz nieprecyzyjna, gdyż wartość średnia po-

miarów jest znacznie przesunięta względem

wartości oczekiwanej (prawdziwej) i obser-

wuje się duży rozrzut wyników.

SUMMARY Analytical method, which

has been well validated, is usually a trump

card for many commercial laboratories,

that use non-normalized or normalized

but modiﬁ ed methods. Sometimes

the time spent for validation process,

plays a very important role in gaining

the client. That’s why it is extremely

important to choose proper validation

parameters, which are necessary and

sufﬁ cient enough to decide whether

the method is suitable for speciﬁ c

analytical usage. This paper is the ﬁ nal

part describing validation parameters.

KEY WORDS validation of analytical

methods, analytical method, accuracy,

precision, uncertainty, stability

GRANICE WYKRYWALNOŚCI

I OZNACZALNOŚCI

Pod pojęciem granicy wykrywalności metody

analitycznej ( Limit of Detection – LOD)

rozumie się najmniejszą ilość lub najmniej-

sze stężenie substancji (pierwiastka, jonu,

związku) możliwe do wykrycia, ale nieko-

niecznie oznaczenia w danych warunkach

eksperymentalnych (3) za pomocą odpo-

wiedniej techniki analitycznej z określonym

prawdopodobieństwem. Inaczej mówiąc,

jest to minimalna ilość badanego analitu,

obecności której jesteśmy pewni w próbce

poddawanej badaniu. Według przewodników

mgr inż. Marta Piechowska

D okładność definiowana jest jako

... W LABORATORIUM | LABORATORIUM 9/2009

EURACHEM (4) granica wykrywalności

to punkt, w którym mierzona wartość jest

większa od niepewności z nią związanej.

Parametr ten jest powiązany ścisłą zależ-

nością z określoną procedurą analityczną,

ponieważ jego wartość zależy od zawar-

tości oznaczanego składnika oraz obec-

ności innych składników występujących

w analizowanej próbce (5). Wynika stąd,

że poziom szumów generowanych przez

urządzenie pomiarowe wpływa w istotny

sposób na granicę wykrywalności badanej

substancji. LOD dotyczy analiz śladowych,

dlatego nie zachodzi potrzeba wyznaczania

go w przypadku walidacji metod jakościo-

wych ani też ilościowych, jeżeli metoda nie

obejmuje analizy śladów, według przewod-

ników ICH Guidelines (6).

Granica oznaczalności ( Limit of Quan-

tification – LOQ) jest to najmniejsza ilość

lub też najmniejsze stężenie substancji, które

można oznaczyć daną metodą analityczną,

zapewniającą uzyskanie wyników pomiarów

z odpowiednią precyzją i dokładnością

(4, 7). Parametr ten wyznacza się w przypad-

ku walidacji metody ilościowej. Jego wartość

jest zawsze wielokrotnością wyznaczonej

wartości granicy wykrywalności LOD.

Najczęściej jako poziom granicy oznaczal-

ności przyjmuje się trzykrotną wartość

granicy wykrywalności. W literaturze po-

dawane są różne formuły na wyznaczanie

granic wykrywalności LOD i oznaczalności

LOQ. Dlatego też wyniki uzyskiwane przez

różne laboratoria, mimo tych samych pró-

bek lub identycznej techniki, zawsze będą

wykazywać pewne różnice, w zależności

od przyjętego wzoru. W tabeli 1 znajduje

się zestawienie najczęściej pojawiających się

formuł przydatnych do obliczania omawia-

nych parametrów (3).

LOD LOQ

3.28 · s b x b + 3.28 · s b

x b + 3 · s b x b + 10 · s b

3.29 · s b 10·s b

k · s b x b + k · s b

x b + 3 · s b x b + 6 · s b

Tabela 1. Zestawienie najczęściej używanych wzorów

podczas wyznaczania granicy wykrywalności LOD oraz

oznaczalności LOQ (3).

X b – wartość średnia z przynajmniej 10 pomiarów ślepej próby;

S b – odchylenie standardowe z pomiarów dla ślepej próby

w takich roztworach zmian oraz kontrolo-

wać ten proces tak, aby mógł zareagować

w odpowiednim czasie.

Stąd też bardzo przydatnym parametrem

jest stabilność; poprzez jej wyznaczenie

możliwe jest zbadanie stopnia niezmienno-

ści bądź też zmienności sygnału analitycz-

nego w określonym czasie. Kontrola stabil-

ności próbek pozwala uniknąć poważnych

błędów w trakcie dalszych etapów analiz.

Dodatkowo odpowiednia analiza otrzy-

manych w trakcie wyznaczania stabilno-

ści wyników może dostarczyć analitykowi

wielu ważnych informacji na temat stopnia

zmienności zachodzących w próbce pro-

cesów w jednostce czasu, a więc pozwala

zaobserwować pewne trendy zmienności

STABILNOŚĆ METODY

Próbki pobrane i przechowywane do anali-

zy ulegają w różnym stopniu przemianom

fizykochemicznym oraz biochemicznym.

Zawartość poszczególnych związków i pier-

wiastków w badanych próbkach zmienia

się w czasie. Aby zachować niezmienność

badanych próbek, stosuje się odpowiednie

procedury ich pobierania oraz przechowy-

wania (8). Przemianom podlegają również

roztwory przygotowane do analiz próbek

oraz roztwory standardów i odczynników

używanych w procesie analitycznym. Ana-

lityk musi być świadomy zachodzących

reklama

INNOWACYJNE

rozwiązania oraz aplikacje

Bezpośredni kontakt, wsparcie techniczne oraz serwis zawsze na miejscu

Technologie bezpieczne i przyjazne dla środowiska

Najwyższa jakość produktów:

– Cyfrowa elektrochemia: HQD, ECOLINE

– Spektrofotometry: DR2800, DR3800, DR5000

– Sondy: NH4D, LDO, SONATAX sc

– Kolorymetry POCKET: wraz z testami kuwetowymi

HACH LANGE Sp. z o.o., 52-013 Wrocław, ul. Opolska 143a, tel. 071 342 10 83, fax 071 342 10 79, info@hach-lange.pl

www.hach-lange.pl

LABORATORIUM 9/2009 | ... W LABORATORIUM

zawartości poszczególnych składników

w roztworach.

Warunkiem stabilności metody anali-

tycznej jest trwałość roztworów, odczyn-

ników, standardów i badanych próbek

przynajmniej przez 48 h (8). Parametr ten

jest określany jako odchylenie wyników ba-

dań jednego z roztworów analizowanego

z zachowaniem warunków powtarzalności

(to samo laboratorium, ten sam analityk,

ta sama metoda, ten sam sprzęt), np. co

godzinę przez kolejne 48 h. Najlepszym

sposobem sprawdzenia stabilności jest

porównanie wyników pomiarów po 24 h

lub 48 h z wynikami uzyskanymi tuż po

ich sporządzeniu. Jeśli różnica wynosi

≤2% (w przypadku analiz jakościowych)

lub ≤5% (w przypadku analiz śladowych),

to roztwór taki uznawany jest za stabilny

przez 24 h lub 48 h (8).

Należy również zwrócić szczególną uwa-

gę na fakt, iż stabilność procesu analityczne-

go nie gwarantuje uzyskiwania dokładnych

wyników. Proces może być stabilny i dawać

ponad 90% wyników niedokładnych lub

niespełniających odpowiednich wymagań.

Stabilność nie jest więc parametrem wy-

znaczanym w procesie walidacji „zamiast”,

ale powinna być wyznaczany dodatkowo,

ze szczególnym zwróceniem uwagi na pre-

cyzję pomiarów.

Metoda I

xxxxxxxxxx

μ x

stężenie składnika C

Metoda II

μ x

xxxxxxxx

stężenie składnika C

Metoda III

x x x x xxxx x x x x x

μ x

x xx

stężenie składnika C

Metoda IV

xxxx

μ x

xxxxxxx

stężenie składnika C

Rys. 1. Precyzja i poprawność czterech metod analitycznych (3)

– metody typu B, gdzie ocena wyników

odbywa się za pomocą pomiarów prze-

prowadzonych już wcześniej, wiedzy

i doświadczenia dotyczącego zacho-

wania stosowanego przyrządu pomia-

rowego, danych dostarczonych przez

producenta aparatury bądź odczynni-

ków, danych uzyskanych z literatury,

modelu zjawisk oraz danych uzyskanych

podczas wzorcowania.

Proces szacowania niepewności

przebiega według następującego sche-

matu (12):

– specyfikacja wielkości mierzonej – usta-

lenie zależności matematycznej mię-

dzy wartością mierzoną (wyjściową) y

a wielkościami wejściowymi x i ,

– identyfikacja źródeł niepewności,

– wyrażenie ilościowe składników nie-

pewności, czyli wyznaczenie standar-

dowych niepewności u dla poszcze-

gólnych źródeł niepewności,

– weryfikacja składników o dużych war-

tościach niepewności,

– obliczenieniepewności u c (y) złożonej

zgodnie z zasadami dodawania nie-

pewności według wzoru [2];

gdzie:

u c (y) – niepewność złożona,

u 1 , u 2 ,..., u n – niepewności standardowe

wynikające z poszczególnych źródeł

niepewności,

– obliczenie niepewności rozszerzo-

nej U określającej przedział, w którym

z prawdopodobieństwem 0,95 znajduje

się wartość wielkości mierzonej. Otrzy-

muje się ją przez pomnożenie złożonej

niepewności standardowej przez współ-

czynnik rozszerzenia k , który dla tej

wartości prawdopodobieństwa przyj-

muje w przybliżeniu wartość 2 (do-

kładnie 1,96).

NIEPEWNOŚĆ

WYNIKU KOŃCOWEGO

Międzynarodowy Słownik Podstawowych i Ogól-

nych Terminów Metrologii definiuje niepew-

ność jako parametr związany z wynikiem

pomiaru, charakteryzujący rozrzut wartości,

które można w uzasadniony sposób przy-

pisać wielkości mierzonej (9). Niepewność

można wyrazić jako odchylenie standardo-

we albo współczynnik zmienności, które

zostały wyznaczone przy zachowaniu wa-

runków powtarzalności/odtwarzalności

w trakcie walidacji metody analitycznej (10).

Niepewność może być również wyrażona

jako połowa szerokości przedziału ufności

odpowiadającego określonemu poziomowi

istotności (10).

Na niepewność wyniku wpływa bardzo

dużo czynników związanych z samym za-

planowaniem metody, badaniami i wreszcie

samym wynikiem. Istnieje podział na różne

metody szacowania niepewności (11):

– metody typu A, w której niepewność

szacuje się, korzystając z wyników sta-

tystycznych serii badań tego samego

obiektu i wyraża się jako odchylenie

standardowe,

RAPORT Z WALIDACJI

Przebieg charakteryzacji metody ba-

dawczej oraz wyniki powinny być udo-

kumentowane i przechowywane w taki

sposób, aby w każdej chwili mogły być

dostępne dla użytkownika. Dokumenty

te w trakcie procesu akredytacji stano-

wią jeden z dowodów na to, iż laborato-

rium opanowało daną metodę badawczą

i kwalifikuje się do akredytacji. Raport

końcowy z przeprowadzonego procesu

walidacji metody powinien zawierać na-

stępujące dane (13):

(

)

...

[2]

... W LABORATORIUM | LABORATORIUM 9/2009

– przedmiot i cel metody badań (zakres

jej stosowalności, jej rodzaj),

– podstawy metrologiczne,

– rodzaj analitu (-ów) i skład matrycy,

– spis wszystkich wykorzystywanych od-

czynników, wzorców, materiałów odnie-

sienia wraz z ich dokładną specyfikacją

(czystość, jakość, producent, w przypad-

ku syntezy w laboratorium – dokładny

opis tej syntezy),

– opis procedur służących do sprawdza-

nia czystości stosowanych substancji

i jakości wykorzystywanych wzorców,

– środki ostrożności,

– szczegółowy opis warunków przepro-

wadzenia procedury analitycznej,

– opis postępowania statystycznego

wraz z załączonymi odpowiednimi

równaniami i obliczeniami,

– opis procedury w celu kontroli jakości

w przypadku analiz rutynowych,

– odpowiednie rysunki i wykresy, np.

chromatografy, krzywe kalibracyjne,

– zgodność wyznaczonych parametrów

metody z założonymi wartościami

granicznymi,

– wartość niepewności pomiaru anali-

tycznego,

– kryteria, które należy spełnić w pro-

cesie rewalidacji,

– imię i nazwisko osoby przeprowadza-

jącej proces walidacji,

– podsumowanie i wnioski,

– spis wykorzystywanej literatury,

– potwierdzenie i podpis osoby odpo-

wiedzialnej za sprawdzenie i zatwier-

dzenie procesu walidacji. 

6. ICH Guidelines: Validation of Analytical

Methods: Definitions and Terminology . Lon-

dyn 1995.

7. Rozporządzenie Ministra Środowiska z dnia

11 lutego 2004 r. w sprawie klasyfikacji dla

prezentowania stanu wód powierzchniowych

i podziemnych, sposobu prowadzenia moni-

toringu oraz sposobu interpretacji wyników

i prezentacji stanu tych wód (Dz.U. nr 32,

poz. 284).

8. Szczepaniak W.: Metody instrumentalne

w analizie chemicznej. Wydawnictwo Nau-

kowe PWN, 2002.

9. ISO Guide 99: International Vocabulary

of Basic and General Terms in Metrology . Ge-

neva. 1993.

10. EURACHEM/CITAC. Quantifying Uncer-

tainty in Analytical Measurement . 2 nd Edi-

tion. 2000.

11. Materiały z VII Sympozjum Klubu Polskich

Laboratoriów Badawczych: Walidacja me-

tod badawczych. Referat y. Pollab, Zakopane

2001.

12.POLLAB. 2002: Przewodnik EURA-

CHEM/CITAC. Wyrażanie niepewności

pomiaru analitycznego . Biuletyn POLLAB.

2/37/2002. Warszawa.

13.PN-EN ISO/IEC 17025 (2001): Ogólne

wymagania dotyczące kompetencji laborato-

riów badawczych i wzorcujących.

Piśmiennictwo

1. PN-ISO 5725-1 (2002): Dokładność (po-

prawność i precyzja) metod pomiarowych

i wyników pomiarów. Część 1: Ogólne zasady

i definicje.

2. PN-ISO 3534-1 (2002): Statystyka. Terminolo-

gia i symbole – Część 1: Ogólne terminy z zakresu

rachunku prawdopodobieństwa i statystyki.

3. Szczepańska J., Kmiecik E.: Statystyczna

kontrola jakości danych w monitoringu wód

podziemnych. Wydawnictwa AGH, Kraków

1998.

4. EURACHEM: The Fitness for Purpose of Ana-

lytical Methods. A laboratory Guide to Method

Validation and Related Topics. Eurachem,

December 1998.

5. Konieczka P.: Walidacja metodyk analitycz-

nych. Politechnika Gdańska. Wydział Che-

miczny. Katedra Chemii Analitycznej.

reklama

Laboratoryjne systemy uzdatniania wody

źródło wody w Twoim laboratorium

www. hlpolska .pl

Hydrolab Polska

80-126 Gdańsk,

ul. Myśliwska 10

tel.: 058 341 16 69

tel.: 058 341 90 00

biuro@hlpolska.pl

ISO 9001:2001 Projektowanie, produkcja, serwis laboratoryjnych systemów uzdatniania wody

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: