elektroforeza.pdf

ELEKTROFOREZA

PRZYKŁADY ZASTOSOWAŃ

Opracowanie zbiorowe pod redakcją

Bogdana Walkowiaka i Violetty Kochmańskiej

SPIS TREŚCI

O BJAŚNIENIA SKRìTìW UŻYWANYCH W OPRACOWANIU ..................................................................... 3

W STĘP ............................................................................................................................................................... 5

E LEKTROFOREZA JAKO TECHNIKA SEPARACJI MAKROCZĄSTECZEK Î Walkowiak B......................... 6

- P ODSTAWY TEORETYCZNE ................................................................................................................................ 7

- R ODZAJE NOŚNIKìW ELEKTROFORETYCZNYCH ............................................................................................... 10

- R ODZAJE KOMìR ELEKTROFORETYCZNYCH .................................................................................................... 12

- R ODZAJE ELEKTROFOREZY ............................................................................................................................. 13

- P RZYGOTOWANIE PRìBEK DO ELEKTROFOREZY .............................................................................................. 18

- B ARWIENIE , DOKUMENTACJA ORAZ ANALIZA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA ........................................................ 20

1 - ANTYTRYPSYNY Î Piłacik B................................................................................ 52

7. E LEKTROFORETYCZNE ROZDZIAŁY BIAŁEK GENERATYWNYCH CZĘŚCI ROŚLIN Î Kalinowski A.,

Radłowski M.............................................................................................................................................. 55

8. K RZYWE MIARECZKOWANIA ELEKTROFORETYCZNEGO Î Buchowiecka A., Peltre G................................ 61

9. M INIATUROWA ELEKTROFOREZA DWUKIERUNKOWA (m2D) BIAŁEK Z GENERATYWNYCH

CZĘŚCI ROŚLIN Î Kalinowski A., Radłowski M......................................................................................... 68

10. Z ASTOSOWANIE ELEKTROFOREZY DWUKIERUNKOWEJ W ANALIZIE BIAŁEK KOMìREK MDCK

ZAKAŻONYCH WIRUSEM INFLUENZY KONI Î Rożek W................................................................................ 75

11. A NALIZA PROFILU BIAŁKOWEGO KOMìREK ŚRìDBŁONKA ZA POMOCĄ ELEKTROFOREZY

DWUKIERUNKOWEJ Z UŻYCIEM SYSTEMU E TTAN D ALT Î Pawłowska Z...................................................... 81

12. E FEKTYWNOŚĆ TRANSFERU BIAŁEK Z ŻELU POLIAKRYLAMIDOWEGO PRZY POMOCY TECHNIKI

TRANSFERU PìŁSUCHEGO Î Walkowiak B., Walkowiak A........................................................................ 84

13. I MMUNOBLOTING BIAŁEK MIĘSA Î Greaser ML., Pospiech E., Fritz J., Swartz DR.................................. 90

14. A NALIZA GENETYCZNA RODZIN OBCIĄŻONYCH ZESPOŁEM MEN 2A Î WYKRYWANIE

GERMINALNYCH MUTACJI PROTOONKOGENU RET METODĄ PCR-SSCP Î Bartkowiak J., Rieske P.,

Piaskowski S............................................................................................................................................. 94

15. D IAGNOSTYKA WIRUSA CHOROBY PĘCHERZYKOWEJ ŚWIŃ (SVD) Î Niedbalski W., Kęsy A..................... 98

16. E LEKTROFORETYCZNE OCZYSZCZANIE BIAŁEK Z NADEKSPRESJI W KOMìRKACH E.Coli - Szalata M.,

Kalak R., Lipiński D., Pławski A., Słomski R.......................................................................................... 101

17. F RAKCJONOWANIE W ŻELU POLIAKRYLOAMIDOWYM I DETEKCJA FLUORESCENCJI FRAGMENTìW DNA

ZAWIERAJĄCYCH POWTìRZENIA MINISATELITARNE Î Słomski R., Kowalska K., Słomska K., Jura J.,

Szalata M................................................................................................................................................. 106

18. B EZPOŚREDNIE SEKWENCJONOWANIE PRODUKTU PCR Z ZASTOSOWANIEM STARTERìW

ZNAKOWANYCH INDODIKARBOCYJANINO (C Y 5) FOSFOROAMIDEM - Pławski A., Lipiński D.,

Kala M., Słomski R................................................................................................................................. 112

19. A NALIZA SEKWENCJI DNA METODĄ IZOTERMICZNĄ KLONìW WYSELEKCJONOWANYCH Z BIBLIOTEKI

C DNA ŁUBINU ŻìŁTEGO Î Nuc K., Słomski R........................................................................................ 116

20. W YKRYWANIE MUTACJI PUNKTOWYCH W GENIE SUPRESOROWYM APC CZŁOWIEKA METODĄ

HETERODUPLEKSìW Î Pławski A., Lipiński M., Słomski R..................................................................... 119

P RZYKŁADY ZASTOSOWAŃ ........................................................................................................................ 23

1. D ETEKCJA FOSFORYLACJI BIAŁEK POWIERZCHNIOWYCH BŁON KOMìREK ŚRìDBŁONKA

Z UDZIAŁEM EKTOKINAZ BIAŁKOWYCH Î Pawłowska Z. ......................................................................... 25

2. F OSFORYLACJA BIAŁEK W PŁYTKACH KRWI STYMULOWANYCH KOLAGENEM C Kralisz U........................ 29

3. O CENA POZIOMU FOSFORYLACJI BIAŁEK PŁYTEK KRWI AKTYWOWANYCH ADP U CHORYCH

Z PRZEWLEKŁĄ NIEWYDOLNOŚCIĄ NEREK Î Walkowiak B., Tański W., Koziołkiewicz W....................... 35

4. R OZDZIAŁ ELEKTROFORETYCZNY BIAŁEK MIĘSA PRZY UŻYCIU SDS-PAGE Z DODATKIEM

8M MOCZNIKA Î Greaser ML., Pospiech E., Fritz J., Swartz DR., Grześ B. ........................................... 43

5. E LEKTROFOREZA BIAŁEK MIĘSA O MASIE POWYŻEJ 200 K W ŻELU AGAROZOWYM Î Greaser ML.,

Kumazawa Y., Pospiech E. ...................................................................................................................... 48

6. O CENA FENOTYPìW

OBJAŚNIENIA SKRìTìW UŻYWANYCH W OPRACOWANIU

1D Î symboliczne oznaczenie pierwszego kierunku w elektroforezie

dwuwymiarowej

2D Î symboliczne oznaczenie elektroforezy dwuwymiarowej (dwukierunkowej)

4G10 Î przeciwciało monoklonalne rozpoznające ufosforylowaną formę tyrozyny

125 I Î izotop jodu o masie atomowej 125

131 I Î izotop jodu o masie atomowej 131

14 C Î izotop węgla o masie atomowej 14

3 H Î izotop wodoru o masie atomowej 3 (tryt)

32 P Î izotop fosforu o masie atomowej 32

35 S Î izotop siarki o masie atomowej 35

9D10 Î przeciwciało monoklonalne anty-titina (supernatant komrkowy)

A Î symbol nukleotydu a denozyny

ACD Î antykoagulant w skład ktrego wchodzą: kwas cytrynowy, cytrynian sodowy i

cukier glukoza, nazwa zwyczajowa: ( ang. a cid c itrate d extrose )

ADP Î nukleotyd dwufosforan adenozyny

AMP Î nukleotyd monofosforan adenozyny

ATP Î nukleotyd trjfosforan adenozyny

BSA Î albumina wołowa ( ang. b ovine s erum a lbumin )

bp Î oznaczenie liczby par zasad DNA ( ang. b ase p air )

C Î symbol nukleotydu c ytozyny

C Î procentowy udział bis-akrylamidu w całkowitej ilości akrylamidu

CAPS Î 3-[cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid

cDNA Î jednoniciowa postać DNA, będąca kopią RNA, uzyskana w wyniku działania

odwrotnej transkryptazy

CHAPS Î 3-(3-cholamidopropyl) dimethylammonio-1-propane sulfonate

DATD Î N,N Ó - diallyltartardiamide

DMEM Î medium hodowli komrkowej

DNA Î kwas deoksyrybonukleinowy

DTT Î 1,4- d i t io t reitol

EDTA Î kwas etylenodiaminotetraoctowy (wersenian dwusodowy) ( ang.

e thylene d iamine t etraacetic a cid )

dpi Î jednostka rozdzielczości optycznej skanera ( ang. d ot p er i nch )

FBS Î wołowa surowica płodowa ( ang. f etal b ovine s erum )

Fc Î fragment cząsteczki immunoglobuliny nie zawierający miejsc rozpoznających

antygen

FCS Î cielęca surowica płodowa ( ang. f etal c alf s erum )

G Î symbol nukleotydu g uaniny

HAT Î dodatek do medium hodowli komrkowej ( ang. h ypoxantine, a minophterin

and t hymidine )

HPCE Î wysokosprawna elektroforeza kapilarna ( ang. h igh p erformance c apilary

e lectrophoresis )

HUVEC Î ludzkie komrki endotelialne ( ang. h uman u mbilical v ein e ndothelial c ells )

IEF

Î rodzaj elektroforezy wykorzystujacy rżnicę wartości punktu

izoelektrycznego rozdzielanych makrocząsteczek ( ang. i so e lectro f ocusing )

IFN-

Î interferon gamma

IgG

Î immunoglobulina G

IgM Î immunoglobulina M

IODO-BEADS Î odczynnik, w postaci styrenowych kuleczek z immobilizowaną formą

chloraminy, stosowany do znakowania białek promieniotwrczym izotopem

jodu

K Î symboliczny zapis tysiaca (kilo), umownie w notacji biologicznej stosuje się

duzą literę, choć układ SI rezerwuje dla tego celu małą literę k

M Î symboliczny zapis miliona (mega)

Mab Î symboliczne oznaczenie przeciwciała monoklonalnego ( ang. m onoclonal

a nti b ody )

MHC Î ciężki łańcuch miozyny ( ang. m iosine h eavy c hain )

MW Î masa cząsteczkowa ( ang. m olecular w eight )

NP-40 Î detergent niejonowy nonident P-40

pI Î punkt izoelektryczny - taka wartość pH, w ktrej wypadkowy ładunek

elektryczny cząsteczki jest rwny zeru ( ang. i soelectric p oint )

PBS Î wodny roztwr soli fizjologicznej (0,9% NaCl) buforowanej fosforanami, pH

7,4 ( ang. p hosphate b uffered s aline )

PCR Î reakcja łańcuchowa oparta na zastosowaniu polinukleazy ( ang. p olinuclease

c hain r eaction )

PLCγ2 Î enzym fosfolipaza Cγ2

PMSF Î p henyl m ethyl s ulfonyl f luoride - inhibitor proteaz serynowych

RPMI - medium do hodowli komrek

SDS Î silny detergent jonowy ( ang. s odium d odecyl s ulfate )

SDS-PAGE Î żelowa elektroforeza płytowa wykonywana w akrylamidzie w obecności SDS

( ang. p late a crylamide g el e lectrophoresis )

Sephadex G-25 Î złoże do filtracji żelowej

SSCP Î technika badania polimorfizmu DNA ( ang. s ingle- s trand c onformation

p olymorphism )

T Î symbol nukleotydu t yminy

T Î procentowa zawartość akrylamidu i bis-akrylamidu w żelu

TBS Î wodny roztwr soli fizjologicznej (0,9% NaCl) buforowanej Trisem, pH 7,4

( ang. Tris b uffered s aline )

TBST Î TBS z dodatkiem detergentu Tween 20

TCA Î kwas trjchlorooctowy ( ang. t ri c hloroa c etic a cid )

TEMED Î N,N,NÓ,NÓ-tetramethylenediamine

Tris Î 2-amino-2-hydroxymethylo-1,3-propanediol

Triton X-100 Î niejonowy detergent (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)

Tween 20 Î niejonowy detergent (polyoxyethylenesorbitan monolaurate)

Î symbol nukleotydu u racylu

WSTĘP

Olbrzymia popularność technik elektroforetycznych we wszystkich dziedzinach

dotyczących nauk o życiu nakłada na producentw i dystrybutorw sprzętu do elektroforezy

zwyczajowy obowiązek dostarczania bieżącej i pełnej informacji o tych technikach, ich

możliwościach i nowych aplikacjach. Obowiązek ten realizowany jest całą gamą środkw,

poczynając od dostarczania użytkownikowi katalogw produktw firmy, not aplikacyjnych,

publikacji w firmowych periodykach, filmw instruktażowych czy szkoleń. Oferta ta

dostępna jest zwykle w języku angielskim i nie zawsze trafia do osb oczekujących na szybką

i pełną informację w języku polskim. Dotyczy to głownie początkujących pracownikw

badawczych, ktrych znajomość zagadnień technicznych oraz języka naukowego jest jeszcze

niepełna. Specjalnie z myślą o tych użytkownikach technik elektroforetycznych

przygotowane zostało niniejsze opracowanie. Nie oznacza to jednak, że doświadczeni

badacze nie znajdą w opracowaniu nowych pomysłw i informacji. Autorami przykładw są

pracownicy nauki dobrze posługujący się technikami elektroforetycznymi, żeby nie

powiedzieć eksperci w tej dziedzinie. Przykłady zostały dobrane i przedstawione z myślą

o przekazaniu możliwie dużej porcji informacji w dość skrtowej formie publikacji. Stąd

pełny opis czynności niezbędnych do wykonania wzbogacony o uwagi wskazujące

niebezpieczeństwo związane z wykonywaniem poszczeglnych czynności lub pozwalające

ominąć błędy w postępowaniu.

Opracowanie niniejsze nie stanowi w żadnym razie konkurencji w stosunku do

uznanych podręcznikw i monografii w zakresie elektroforezy. Jest pewnym uzupełnieniem

dostępnej literatury, wzbogaconym dokładnym wyspecyfikowaniem warunkw

przeprowadzenia doświadczenia oraz opisem oczekiwanych wynikw. Jako lekturę

pozwalającą na stosunkowo łatwe przyswojenie wiedzy w tej dziedzinie chcielibyśmy

wskazać monografię Reinera Westemeiera Electrophoresis in Practice, 2 nd edition, A Wiley

Company, Weinheim 1997.

Z powodu ograniczonej objętości niniejszego opracowania zrezygnowano z opisu

aparatury, materiałw eksploatacyjnych, akcesoriw oraz odczynnikw stosowanych

w zaprezentowanych technikach elektroforetycznych. Wszystkie produkty firmy Amersham

Biosciences zaznaczone są w tekście wytłuszczoną czcionką. Pełną informację o tych

produktach można znaleźć w aktualnym katalogu firmy lub na stronie internetowej

www.amershambiosciences.com.

W zakończeniu wstępu edytorzy opracowania wyrażają swoje podziękowanie autorom

przykładw, ktrzy zechcieli znaleźć nieco czasu aby podzielić się swym doświadczeniem

z innymi. Chcemy rwnież podziękować Panu Andrzejowi Reńskiemu, Dyrektorowi

polskiego przedstawicielstwa firmy Amersham Biosciences, za zaproszenie nas do

przygotowania tego opracowania.

Łdź, Warszawa, październik 2002 rok

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: