Właściwości fizykochemiczne aminokwasów, podział aminokwasów, charakterystyka wiązania peptydowego, podział białek, struktura białek, wiązania chemiczne występujące w białkach. Procesy denaturacji i koagulacji. Funkcje białek. Synteza białka.
ĆWICZENIE
Zasada: Związki zawierające wiązanie peptydowe / -CO-NH- / w roztworze zasadowym jonów miedzi tworzą połączenia kompleksowe o barwie fioletowej. Nazwa metody pochodzi od reakcji, jaką daje z jonami miedzi najprostszy związek zawierający wiązanie peptydowe, tzw. biuret - produkt kondensacji dwóch cząsteczek mocznika. Winian sodowo-potasowy wiążąc kompleksowo wodorotlenek miedzi chroni go przed wytrąceniem w środowisku alkalicznym. Nasilenie barwy jest proporcjonalne do stężenia białka i ilości znajdujących się w nim wiązań peptydowych. Reakcja biegnie prawie stechiometrycznie, tzn. ekstynkcja dla jednego rodzaju białka jest zawsze taka sama, zgodna z prawem Lamberta-Beera.
Metoda biuretową jest obowiązująca w rutynowych oznaczeniach ilości białka. Jest to metoda swoista, szybka, dokładna i prosta w wykonaniu. Daje powtarzalne wyniki.
Odczynniki;
Wykonanie: - oznaczenie białka w surowicy krwi lub osoczu lub homogenacie tkankowym
Odmierzyć do probówek:
Badana Ślepa Wzorzec odczynnikowa
surowica lub osocze /ml/ 0,02 - -
0,9% NaCl /ml/ - 0,02 -
wzorzec 6% /ml/ - - 0,02
odczynnik biuretowy /ml/ 1,0 1,0 1,0
Wymieszać, odstawić na 30 min w temperaturze pokojowej. Odczytać A względem ślepej odczynnikowej przy 546 nm /530 - 570 nm/.
Obliczenie
Białko w g/l =A próby/A wzorca x C wzorca =A próby/A wzorca x 6g/dl x 10
Uwagi:Jeżeli surowica jest lipemiczna, żółtaczkowa / powyżej 5 mg/dl bilirubiny/ lub zawiera ślad hemoglobiny należy wykonać ślepą surowiczą. W tym celu należy zmieszać 0,1 ml surowicy z 5 ml alkalicznego roztworu winianu. Ekstynkcję dla ślepej surowiczej, odczytaną względem wody należy odjąć od ekstynkcji dla próby badanej odczytanej względem ślepej odczynnikowej.
Białko w g/l =A próby- A ślepej sur /A wzorca x 6g/dl x 10
|
Zasada: Barwa roztworu jest wynikiem dwóch reakcji:
1/ reakcji biuretowej, pomiędzy wiązaniami peptydowymi i jonami miedzi w środowisku alkalicznym oraz
2/ reakcji kwasu fosforomolibdenonego i fosforowolframowego z obecnymi w białku aminokwasami aromatycznymi – tyrozyną i tryptofanem. Metoda jest znacznie bardziej czuła- 100razy niż metoda biuretowa, nie jest jednak w pełni swoista. Metoda ta nadaje się więc szczególnie do oznaczania białka w płynie mózgowo-rdzeniowym. Nie nadaje się natomiast bezpośrednio do oznaczania białka w moczu, ponieważ zawiera on peptydy i aminokwasy aromatyczne. Białko w moczu należy więc najpierw wytrącić.
Wykonanie roztworu winian węglan:
Roztwór winian- węglan należy sporządzić bezpośrednio przed oznaczeniem białka poprzez zmieszanie:
1 ml 1% winianu sodowo-potasowego
1 ml 0.5% siarczanu miedziowego
98ml 2% węglanu sodowego
Wykonanie krzywej wzorcowej:
Wykonanie krzywej wzorcowej
- z roztworu wzorcowego albuminy (c= 1 mg/ml) sporządzić szereg rozcieńczeń pobierając kolejno po 10, 30, 50, 100, 150, 200 ml, a następnie dopełnić każdą próbkę do objętości 300ml wodą.
Do osobnej probówki napipetować 300ml wody.
Napipetować po 2 ml próbek badanych do osobnych probówek.
Do każdego z odpipetowanych roztworów dodać kolejno:
- 300ml 1N NaOH
- 3ml sporządzonej uprzednio mieszaniny winian-węglan
- Próbki dobrze wymieszać i pozostawić na 15 min. Po tym czasie dodać do każdej próbki 300ml odczynnika Folina. Próbki dobrze wymieszać i pozostawić na 30 min, celem wywołania reakcji barwnej. Po tym czasie mierzyć absorbancję próbek wzorcowych i badanych względem próby ślepej przy długości fali l=500nm.
Obliczenie: Wykreślić krzywą wzorcową. Na osi pionowej odłożyć wartości A, na osi poziomej zawartość białka w próbce w mg i odpowiadając mu ilość białka w mg/ml.
Oznaczenie ilości białka metoda spektrofotornetryczną w ultrafiolecie
Zasada: W skład większości białek wchodzą aminokwasy aromatyczne, takie jak fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan, które powodują charakterystyczną absorpcję światła przy 280 nm. Nasilenie absorpcji jest proporcjonalne do ilości tych aminokwasów, a więc także do ilości białka i może być wykorzystane do bezpośredniego oznaczenia stężenia białka w roztworze. Kwasy nukleinowe absorbujące światło przy 260 nm przeszkadzają przy spektrofotometrycznym oznaczaniu białka. Jest możliwe wyeliminowanie ich wpływu przez dokonanie podwójnego pomiaru ekstynkcji przy 260 i 280 nm, Warburg i Christian podali wzór, który stał się podstawą dla opracowania nomogramu pozwalającego obliczyć zarówno stężenie białka jak i stężenie kwasów nukleinowych z obu pomiarów ekstynkcji przy 260 i 280 nm, metoda wymaga spektrofotometru do UV. Pomiar przeprowadza się w kuwetach kwarcowych. Metoda ta jest ograniczona ze względu na różną zawartość aminokwasów aromatycznych w rożnych białkach. Jest ona 10 razy bardziej czuła niż metoda biuretowa, ale 10 razy mniej czuła niż metoda Lowry'ego. Jest to metoda bardzo cenna przy porównawczej ocenie stężenia białka np we frakcjach uzyskiwanych podczas rozdziałów na kolumnach. Roztwór po przeprowadzonym pomiarze może być następnie wykorzystany do innego oznaczenia.
Celem oznaczenia ilości białka, przygotować roztwór tego białka w soli fizjologicznej, przez zmieszanie 20ml próbki białka i dopełnienie do 1.5 ml solą fizjologiczną. Zmierzyć absorbancję tak przygotowanej próbki wobec ślepej zawierającej sól fizjologiczną na spektrofotometrze, w kwarcowych kuwetach o d= 1cm, przy długości fali l= 280nm w temp. 25oC. Przeliczyć stężenie białka wg nomogramu Wartburga
260 nm
Nomogram do oznaczania stężenia białka i kwasów nukleinowych /KN/ na podstawie wartości, ekstynkcji przy 260 i 280 nm. Uzyskane wartości ekstynkcji, przy 260 i 280 nm połączyć linią prostą. Punkt przecięcia tej prostej z podziałką po stronie lewej wyznacza stężenie białka w mg/ml = mg/ml. Punkt przecięcia tej prostej po stronie prawej wyznacza, na podziałce stężenie kwasów nukleinowych w mg/ml = mg/ml
Metoda biuretowa jest obecnie zalecaną w rutynowej pracy. Nadaje się zwłaszcza do oznaczania białka w surowicy krwi. Jest to metoda swoista, szybka i prosta w wykonaniu, a dla surowicy krwi dostatecznie czuła. Wyniki są w pełni powtarzalne. Dla oznaczenia białka w płynie mózgowo-rdzeniowym wymagana jest w tej metodzie duża objętość płynu. Do substancji mających wpływ na wynik oznaczenia należą; jony amonowe, peptydy, dekstran, Tris, mannit, sacharoza, fikol. W moczu przed oznaczeniem konieczne jest uprzednie wytrącenie białka.
Metoda Lowry’ego i wsp jest jedną z najczulszych metod nie jest jednak swoistą. W reakcje mogą wchodzić aminokwasy aromatyczne/ tyrozyna i peptydy, a w niektórych materiałach również fenole, kwas moczowy, ksantyna. Metoda ta nadaje się do oznaczania pewnych białek występujących w surowicy krwi, dopiero po ich rozfrakcjonowaniu, np.: fibrynogenu, seromukoidu itp.
Pomiar ekstynkcji przy 280 nm znalazł zastosowanie do szybkiej oceny stężenia białka we frakcjach rozdzielanych chromatograficznie na kolumnach. Białka nie zawierające aminokwasów aromatycznych / niektóre histony/ tą metodą nie mogą być oznaczane. Metoda jest szybka, nie wymaga przygotowania próbek, jest 10 razy bardziej czuła niż metoda biuretowa, ale 10 razy mniej czuła niż metoda Lowry'ego. Nie jest jednak w pełni swoista. Należy dokonywać korekty na zawarte w płynie kwasy nukleinowe i nukleotydy, po przeprowadzeniu drugiego pomiaru przy 260 nm. Absorpcję światła wykazują również wolne aminokwasy aromatyczne i peptydy. Metoda ta wymaga spektrofotometru do pomiaru w UV.
Metody strąceniowe są obecnie stosowane dla oceny ilości białka w płynie mózgowo-rdzeniowym i moczu. Są swoiste, szybkie i czułe. Jedyną przeszkodę mogą stanowić obecne lipidy. Ślepa pozwala jednak na wyeliminowanie zmętnienia próbki. Metoda Extona jest metodą zalecaną w pracy rutynowej.
nie_za_pominajka